草莓鑲脈病毒P6蛋白的胞內(nèi)運輸及其重要功能域的鑒定.pdf

1、SVBV能夠在草莓葉肉細(xì)胞內(nèi)形成含病毒粒子的內(nèi)含體，為了鑒定內(nèi)含體的組成，在本氏煙中異位表達(dá)了SVBV的6個閱讀框，結(jié)果顯示，只有P6蛋白能夠自身聚集，形成大小不一的不定型內(nèi)含體，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布。利用熒光蛋白標(biāo)記微管、微絲和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)P6內(nèi)含體能排列在微管和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并且可以沿著微絲移動。另外，P6蛋白和P1蛋白能夠共定位在細(xì)胞邊界上，說明攜帶病毒粒子的內(nèi)含體可能是通過細(xì)胞骨架到達(dá)細(xì)胞邊界的。而P6蛋白的核定位信號缺失突變

2、體不能被運輸進(jìn)細(xì)胞核，也不能在細(xì)胞質(zhì)中形成內(nèi)含體，并且喪失促進(jìn)外源基因GFP表達(dá)的能力，因此，認(rèn)為P6蛋白的核定位信號是其行使生物功能的一個重要功能域。
　　1、 SVBV P6蛋白能夠形成內(nèi)含體
　　構(gòu)建 pCAM-P1-YFP、pCAM-P2-GFP、pCAM-P3-GFP、pCAM-P4-GFP、pCAM-P5-GFP和pCAM-P6-GFP的雙元表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后浸潤本氏煙葉片，發(fā)現(xiàn)SVBV各ORF能夠在細(xì)胞質(zhì)中

3、產(chǎn)生不同的熒光信號。P1-GFP能夠在細(xì)胞邊界上形成點狀結(jié)構(gòu)。P2-GFP在有些細(xì)胞中呈絲狀分布，但是在另外一部分細(xì)胞中同時呈現(xiàn)絲狀和點狀分布。P3-GFP沿著細(xì)胞膜分布。P4-GFP和P5-GFP的熒光分布與單獨表達(dá)GFP相似，綠色熒光均勻分布在細(xì)胞邊界上。P6-GFP在細(xì)胞中形成大小不一、不規(guī)則的內(nèi)含體，表明P6蛋白是SVBV侵染的寄主細(xì)胞中內(nèi)含體的重要成分。
　　2、 SVBV P6內(nèi)含體能定位在細(xì)胞核、細(xì)胞骨架和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但

4、不能與葉綠體共定位
　　含pCAM-P6-GFP的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙，將浸潤的組織用DAPI染色，結(jié)果表明，P6蛋白能定位在細(xì)胞核上，同時細(xì)胞質(zhì)中也存在內(nèi)含體。為了進(jìn)一步驗證較小的內(nèi)含體的定位情況，將能表達(dá)微絲標(biāo)簽蛋白、微管標(biāo)簽蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)簽蛋白的農(nóng)桿菌分別和含pCAM-P6-GFP的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，帶有綠色熒光標(biāo)簽的P6內(nèi)含體能夠夠排列在綠色熒光標(biāo)記的微絲、紅色熒光標(biāo)記的微管和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。然而，G

5、FP標(biāo)記的內(nèi)含體與葉綠體的自發(fā)熒光并不能共定位，多數(shù) P6包涵體存在于葉綠體的縫隙之間。表明 P6蛋白在細(xì)胞中形成一個大的內(nèi)含體定位在細(xì)胞核上，而產(chǎn)生的較小的內(nèi)含體定位在細(xì)胞骨架和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與葉綠體無明顯的定位關(guān)系。
　　3、 SVBV P6內(nèi)含體沿著微絲移動并且與P1共定位在細(xì)胞邊界上
　　含pCAM-P6-GFP的農(nóng)桿菌和能表達(dá)微絲標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙，發(fā)現(xiàn)P6內(nèi)含體沿著微絲移動，可以從微絲的一端運動到另外一端，

6、并且內(nèi)含體在運動過程中，微絲能夠保持穩(wěn)定。pCAM-P6-RFP和pCAM-P1-YFP共浸潤本氏煙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P6蛋白與P1蛋白共定位在細(xì)胞邊界上，推測P6蛋白攜帶病毒粒子沿著微絲移動到細(xì)胞邊界，與定位在胞間連絲上的運動蛋白共定位。
　　4、 SVBV P6蛋白與SVBV編碼的其他蛋白間的互作
　　酵母雙雜交驗證SVBV P6蛋白與SVBV編碼其他蛋白間的互作。質(zhì)粒AD-P6與BK-P1和 BK-P6與AD-P1分別共轉(zhuǎn)化

7、酵母，但是轉(zhuǎn)化后的酵母并不能在四缺板上正常生長，然而陽性對照在四缺板上生長良好，表明 P6蛋白與 P1蛋白不能互作。用同樣的方法驗證P6和P3之間的互作關(guān)系，結(jié)果表明，P6蛋白與其自身編碼的P1和 P3都不互作。
　　5、 SVBV P6蛋白的25個氨基酸影響其核定位功能及內(nèi)含體的形成
　　利用核定位分析軟件預(yù)測P6的核定位信號，發(fā)現(xiàn)2個核定位信號分別位于P6蛋白的193aa-223 aa和402aa-426aa。為了驗證預(yù)

8、測結(jié)果的可靠性，構(gòu)建了2個P6蛋白核定位信號的缺失突變體 M1（缺失193aa-223aa）和M2（缺失402 aa-426aa），分別浸潤本氏煙葉片，結(jié)果顯示，大約有50％的細(xì)胞中M1形成的大內(nèi)含體可以定位在細(xì)胞核上，其余細(xì)胞M1形成的大內(nèi)含體定位在鄰近細(xì)胞核的位置, M1依舊可以形成細(xì)胞質(zhì)小內(nèi)含體。M2不能進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞內(nèi)也不能形成內(nèi)含體。證明402aa-426aa是主要的核定位信號。利用 Simian vacuolating

9、virus40（SV40）的核定位信號回補(bǔ)M2（M5），發(fā)現(xiàn)SV40核定位信號能夠回復(fù)M2的核定位功能，P6蛋白全部進(jìn)入細(xì)胞核中。
　　進(jìn)一步構(gòu)建了不含有25個aa的突變體M3(1aa-401aa)和含有25個aa突變體M4(1aa-426aa)，發(fā)現(xiàn)這2個突變體熒光分布與M2相似，均不能定位在細(xì)胞核，也不能在細(xì)胞質(zhì)中形成包涵體。表明這25個aa雖然對P6內(nèi)含體的形成非常重要，但不是形成P6內(nèi)含體的決定性功能域，推測P6蛋白426

10、aa下游的的區(qū)域也可能參與包涵體的形成。
　　6、 SVBV P6蛋白的25個氨基酸影響P6促進(jìn)外源基因GFP表達(dá)
　　P6、M1和M2分別與GFP共浸潤本氏煙葉片，發(fā)現(xiàn)浸潤P6和M1的本氏煙葉片和浸潤陽性對照P19一樣，均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色熒光；而浸潤M2的本氏煙葉片綠色熒光明顯較弱，和浸潤空載體的熒光強(qiáng)度一致，說明缺失25個aa的突變體M2喪失了促進(jìn)外源基因GFP表達(dá)的能力。Northern blot和Western bl

11、ot檢測發(fā)現(xiàn)，浸潤P6和M1的本氏煙葉片中GFP的核酸和蛋白表達(dá)水平均較高，而浸潤M2的本氏煙葉片中GFP的的核酸和蛋白表達(dá)水平顯著降低。SV40核定位信號回補(bǔ)M2（M5），將M5與GFP共浸潤本氏煙葉片，發(fā)現(xiàn)M5和M2一樣不能促進(jìn)外源基因GFP的表達(dá)，說明含有SV40核定位功能的P6突變體并不能行使P6蛋白促進(jìn)外源基因表達(dá)的能力。M5完全定位于細(xì)胞核，而P6不僅定位于細(xì)胞核，而且在細(xì)胞質(zhì)中形成內(nèi)含體，暗示P6蛋白促進(jìn)外源基因的表達(dá)過程