乙型肝炎病毒DNA聚合酶功能域結(jié)合蛋白和反式調(diào)節(jié)基因的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒，HBVDNA長度約為3.2kb，含4個開放讀碼框架(ORF)，分別編碼HBV的表面抗原蛋白，核心/e抗原蛋白，X蛋白以及HBVDNA聚合酶(HBVPo1)。HBVPol基因在ORF中最長，并且與C、S、X基因區(qū)有重疊，其編碼的P蛋白含有3個功能域和1個無意義的隔離片(spacer，SP)，排列順序為N-末端蛋白(TP)，SP，逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)/DNA聚合酶(PR)和核糖核酸酶H(RNaseH)。由

2、于受到不能從病毒體直接純化和在不同的系統(tǒng)中表達有活性的酶的限制，目前對聚合酶及其所編碼的各個功能區(qū)域蛋白質(zhì)的功能的認識還不是很清楚。為了研究病毒蛋白質(zhì)對肝細胞的作用，用酵母雙雜交技術(shù)篩選HBVPol蛋白與肝細胞相互作用蛋白的編碼基因；用基因表達譜芯片技術(shù)，篩選各功能域的反式調(diào)節(jié)基因。 根據(jù)含有HBVPol全基因組cDNA的質(zhì)粒G318A7AF384372，設計了TP、PR和RNaseH引物，PCR擴增后構(gòu)建酵母表達載體pGBKT

3、7-TP、pGBKT7-PR、pGBKT7-RNaseH，用醋酸鋰法轉(zhuǎn)入酵母細胞AH109后，表達各自蛋白，用Westernblotting確定蛋白表達。將轉(zhuǎn)化好的AH109/pGBKT7-TP酵母菌與含有肝cDNA文庫的酵母菌Y187在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基(三缺培養(yǎng)基：SD/-His/-Leu/-Trp，四缺培養(yǎng)基：SD/-Trp-Leu-His-Ade)上進行配合，在鋪有X-α-gal的四缺培養(yǎng)基上進一步篩選。挑取藍色陽性菌落提取酵母質(zhì)粒

4、。測序并進行生物信息學分析。 對TP的研究中，成功得到47個與TP特異性結(jié)合的陽性克隆，包括人類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)、Ⅰ型乙醇脫氫酶γ亞基(ADH3)，也稱為依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶，RNA聚合酶Ⅱ亞單位(hsRPB7)、血漿銅藍蛋白(CP)，去唾液酸糖蛋白受體2(ASGR2)等21種已知功能蛋白質(zhì)基因和19個假設蛋白基因。提示TP可以與人肝細胞內(nèi)某些已知和未知功能蛋白相互結(jié)合，具有較廣泛的生物學功能。

5、 利用基因表達譜芯片技術(shù)研究HBVPol三個功能域TP、PR和RNaseH對肝細胞基因表達譜的影響：設計引物并構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1(-)-TP，pcDNA3.1(-)-PR和pcDNA3.1(-)-RNaseH，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝母細胞瘤細胞系HepG2，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，與轉(zhuǎn)染空白表達載體pcDNA3.1(-)的HepG2細胞進行DNA芯片分析。結(jié)果TP有¨1條基因表達水平上調(diào)，88個基因表達水平下調(diào)。PR有79