EB病毒LMP2 HLA-A-0201限制性CTL表位預(yù)測、篩選及鑒定.pdf

1、目的:
　　 1.從SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫獲得EB病毒(EBV)潛伏膜蛋白2(LMP2)的全長氨基酸序列,利用生物信息軟件對EBV LMP2中的HLA-A*0201限制性CD8+細胞毒特異T細胞(cytotoxicity T cell,CTL)表位進行預(yù)測。
　　 2.篩選以SYFPEITHI預(yù)測的結(jié)果為基礎(chǔ),結(jié)合NetCTL、HLA-Bind和Rankpep預(yù)測的結(jié)果,兼顧本實驗室已經(jīng)研究的多表位片段,綜合分析后

2、,篩選出此片段內(nèi)未報道過的可能性CTL表位肽。
　　 3.鑒定利用和T2細胞結(jié)合的親和力實驗、穩(wěn)定實驗；利用HLA-A2個體外周血PBMC作為效應(yīng)細胞,進行體外細胞毒實驗乳酸脫氫酶(LDH)釋放法、酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)和細胞內(nèi)細胞因了染色(Intracellular Cytokine Staining,ICS)法對篩選的CTL表位進行了鑒定,獲得了2條具有免疫效應(yīng)的EBV LMP2 CTL的優(yōu)勢表位,為EBV分了疫苗

3、的設(shè)計奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.EBV LMP2 HLA-A*0201限制性CTL表位的預(yù)測和篩選
　　 從SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫獲得EBV LMP2全長氨皋酸序列,以Syfpeithi、NetCTL、HLA-Bind、Rankpep等四種在線乍物信息軟件預(yù)測EBV LMP2中的HLA-A*0201限制性CTL表位,綜合分析篩選出EBV LMP2中可能存在的CTL表位肽。
　　 2.表位

4、肽的合成
　　 西安華辰牛物科技有限公司采用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成Fmoc方案進行合成,采用反向高效液相色譜法(RP-HPLC)純化并進行質(zhì)譜法(MS)分析鑒定。
　　 3.CTL表位肽的鑒定
　　 (1)抗原肽與HLA-A*0201分予親和穩(wěn)定實驗:對上述篩選出的CTL表位肽鑒定其與HLA-A*0201分子間的親和穩(wěn)定性,本實驗利用內(nèi)源性抗原加工處理能力缺失(TAP缺陷)的T2細胞,該細胞表面HLA-A*0201分了極

5、不穩(wěn)定,但當(dāng)抗原肽與之結(jié)合后,MHC分了穩(wěn)定性增加,肽與MHC分了結(jié)合力越強,則肽-MHC復(fù)合體穩(wěn)定性越強,從而測定表位肽的親和穩(wěn)定性；
　　 (2)HLA分型:采用葡聚糖-泛影葡酸(Ficoll)等密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞(PBMC),利用FITC標(biāo)記的HLA-A*0201單克隆抗體進行直接免疫熒光檢測,篩選出HLA-A*0201陽性個體的PBMC；
　　 (3)體外細胞毒實驗乳酸脫氫酶(LDH)釋放法:以

6、HLA-A*0201陽性個體PBMC經(jīng)體外刺激培養(yǎng)后作為效應(yīng)細胞,而以負載CTL表位的T2細胞作為靶細胞,利用LDH法檢測效靶比(E:F)為10:1、20:1、40:1時各CTL表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL的細胞毒殺傷活性；
　　 (4)ELISPOT和細胞內(nèi)細胞因子染色(ICS)法:采用人IFN-γ ELISPOT試劑龠對經(jīng)CTL表位刺激后的特異性CTL頻數(shù)即斑點形成細胞(spot forming cell,SFC)數(shù)目進行檢測,

7、使用德國BIO-SYS公司的Bioreader4000型自動斑點分析儀進行自動拍照及斑點計數(shù)；而ICS則是通過免疫熒光標(biāo)記的單抗檢測各CTL表位肽刺激后其特異性CTL細胞分泌的IFN-r水平,采用流式細胞儀檢測特異性CTL的數(shù)目,以此來鑒定EBVLMP2的HLA-A*0201限制性CTL表位。
　　 結(jié)果:
　　 1.CTL表位預(yù)測結(jié)果及初步篩洗
　　 根據(jù)Syfpeithi預(yù)測選擇其分值較高的表位肽,同時結(jié)合N

8、etCTL、HLA-Bind、Rankpep等在線軟件預(yù)測的結(jié)果、國內(nèi)外已經(jīng)報道的CTL表位和本實驗室后續(xù)實驗的需要進行綜合分析,篩選出ALLAAAGGL(211～219)、VFMCLGGLL(423～431)、AAGGLQGIY(215～223)、GGLQGIYVL(217～225)、VLLILAYRR(229～237)5條可能性的CTL表位肽,分別命名為EBp1、EBp7、EBp8、EBp9、EBp10。同時以HLA錯配多肽HLA-

9、A*2402限制性的CTL表位TYGPVFMCL(419～427)作為陰性對照肽,已報道證實的HLA-A*0201限制性的CTL表位LLWTLVVLL(329～337)作為陽性對照肽,分別命名為EBp11和EBp12。
　　 2.CTL表位肽的合成
　　 由西安華辰生物科技有限公司采用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成Fmoc方案進行合成,經(jīng)高效液相色譜法HPLC純化后,獲得純度高于95％的九肽產(chǎn)物,質(zhì)譜法MS鑒定氨基酸序列,測定分了量所得

10、測定值與理論值相符合。高純度的合成肽為表位篩選與鑒定奠定了前提和基礎(chǔ)
　　 3.CTL表位的鑒定
　　 (1)肽親和穩(wěn)定實驗檢測結(jié)果顯示,表位肽ALLAAAGGL(211～219)、AAGGLQGIY(215～223)、GGLQGIYVL(217～225)、VLLILAYRR(229～237)、VFMCLGGLL(423～431)與T2細胞上的HLA-A*0201分了親和力(FI)分別為3.84、3.65、2.79、3.

11、56、2.83,陽性肽LLWTLVVLL(329～337)與陰性肽TYGPVFMCL(419～427)的親和力(FI)則分別為5.00和1.58；而穩(wěn)定性(DC50)分別是>8h、4～6h、<2h、2-4h、<2h,陽性肽LLWTLVVLL(329～337)與陰性肽TYGPVFMCL(419～427)的穩(wěn)定性(DC50)則分別為>8h和<2h。提示,ALLAAAGGL(211～219)和AAGGLQGIY(215～223)即EBp1和E

12、Bp8與T2細胞上的HLA-A0201分子有較高的親和力與穩(wěn)定性。
　　 (2)LDH釋放試驗的結(jié)果顯示,E:T=40:1及20:1時,EBpl和EBp8誘導(dǎo)的CTL對負載EBp1的T2細胞和負載EBp8的T2細胞的殺傷率分別為(37.16±2.28)％、(22.35±2.55)％及(27.92±2.21)％、(18.23±1.89)％,明顯高于陰性對照(10.86±1.49)％、(10.08±2.02)％,(FEBp1=296

13、.056,P<0.05:FEBp1=107.874,P<0.05和FEBp1=255.747,P<0.05:FEBp8=88.201,P<0.05),而與陽性對照(45.50±1.60)％、(24.68±1.04)％相比沒有顯著性差異(P>0.05),因此EBpl和EBp8表現(xiàn)為抗原特異性、MHC限制性殺傷,而其余肽未能誘導(dǎo)出特異性的CTL。
　　 (3)ELISPOT法檢測針對ALLAAAGGL(211～219)、從GGLQG

14、IY(215～223)、GGLQGIYVL(217～225)、VLLILAYRR(229～237)、VFMCLGGLL(423～431)五條表位肽刺激產(chǎn)生IFN-r特異性CTL頻數(shù)均數(shù)分別為306±37、238±24、14±3、6±2、8±2(SFC*/105),陽性肽與陰性肽的特異性CTL頻數(shù)均數(shù)分別為324±29和4±2(SFC*/105)。結(jié)果顯示ALLAAAGGL(211～219)和AAGGLQGIY(215～223)形成的斑點

15、數(shù)與陽性肽無顯著差異(FEBp1=30.859,FEBp8=45.683,P>0.05),明顯高于陰性對照(FEBp1=433.504,FEBp8=363.289,P<0.05)。而其余肽對HLA-A2細胞捉呈的抗原能發(fā)生應(yīng)答而活化,所形成的斑點數(shù)明顯少于陽性肽(P<0.05),與陰性照無顯著差異(P>0.05)。
　　 (4)通過流式細胞儀分析IFN-γ+CD8+雙陽性細胞數(shù)的變化來判定所合成的肽能否刺激PBMC增殖,進而確定

16、這些肽在人PBMC中誘導(dǎo)抗原特異性CTL的能力,以鑒定其是否為特異性CTL表位。結(jié)果表明,經(jīng)ALLAAAGGL(211～219)和AAGGLQGIY(215～223)刺激后,IFN-γ+CD8+雙陽性細胞數(shù)分別為陰性肽刺激組的4.8倍及3.4倍,而其它肽組與陰性對照組比無明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論:
　　 1.經(jīng)Syfpeithi、NetCTL、HLA-Bind、Rankpep等四種在線軟件對EBV LMP2中的HLA-A*

17、0201限制性CTL表位預(yù)測,篩選了5個可能的EBV LMP2 HLA-A*0201限制性CTL表位,即ALLAAAGGL(211～219)、AAGGLQGIY(215～223)、GGLQGIYVL(217～225)、VLLILAYRR(229～237)、VFMCLGGLL(423～431),并委托進行CTL多肽合成。
　　 2.經(jīng)肽親和穩(wěn)定實驗、LDH釋放法、ELISPOT和ICS等方法檢測,ALLAAAGGL(211-219