RNAi抑制Smad6并在TGF-β1作用下對小鼠骨髓源樹突狀細胞生物學特性變化的研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的:探討體外擴增小鼠骨髓來源樹突狀細胞(BMDC)的方法并進行形態(tài)學觀察和生物學特性鑒定。
　　 方法:用重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組小鼠白細胞介素4(rmIL-4)體外誘導小鼠骨髓細胞分化為樹突狀細胞,倒置顯微鏡動態(tài)觀察形態(tài)學變化,流式細胞術(shù)分析細胞表面分子,同時進行刺激初始型T淋巴細胞增殖能力的檢測。
　　 結(jié)果:體外培養(yǎng)9天后小鼠樹突狀細胞可達80％以上

2、,光鏡下可見典型的樹突狀細胞形態(tài)。未成熟DC的細胞表型為CD11Clow、MHCIIlow、CD86low,未成熟Dc經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)后可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥C,細胞表型為CD11chigh曲、MHCIIhigh曲、CD86high,可顯著刺激同種異體混合淋巴細胞增殖。
　　 結(jié)論:本方法可獲得較高純度的骨髓樹突狀細胞,避免了使用傳統(tǒng)磁珠分離方法所帶來的高成本,復雜操作,低產(chǎn)出率的弊端,為研究樹突狀細胞的功能以及運用其開展下游實驗提供材

3、料。
　　 第二部分：
　　 目的:使用已構(gòu)建成功的小鼠Smad6基因RNA干擾(RNAi)慢病毒載體,有效沉默骨髓樹突狀細胞(BMDC)的Smad6基因表達。
　　 方法:運用構(gòu)建好的慢病毒載體,根據(jù)前期試驗所明確的感染復數(shù)對第一部分所培養(yǎng)的小鼠BMDC進行感染,120h后收集細胞,并經(jīng)倒置熒光顯微鏡、RT-PCR,WESTERN BLOT檢測Smad6基因的表達狀況。
　　 結(jié)果:熒光顯微鏡觀察初步推

4、斷病毒感染效率在75％左右,PCR和WESTERN BLOT證實,通過病毒途徑,在BMDC細胞中smad6基因的沉默效約為85％。
　　 結(jié)論:通過使用慢病毒載體,較成功抑制小鼠BMDC中Smad6基因表達。說明運用慢病毒做RNAi載體可以實現(xiàn)對DC細胞某一基因的有效沉默。
　　 第三部分：
　　 目的:探討在Smad6基因被抑制并有TGF-β1刺激的情況下,小鼠骨SH髓源樹突細胞生物學特性是否存在著變化。

5、>　　 方法:分別以GM-CSF和IL-4誘導培養(yǎng)兩批小鼠BMDC,其中一批經(jīng)用慢病毒感染,對細胞進行Smad6基因抑制,6d后同時用TGF-β1刺激,再經(jīng)過48h后分別對兩批細胞進行電鏡觀察、流式細胞術(shù)檢測細胞表型CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ,混合淋巴細胞反應檢測其抗原提呈功能,檢測細胞凋亡情況,收集上清液用ELISA檢測IL-6,IL-12 p70。
　　 結(jié)果:Smad6未干擾組電鏡下DC成熟樣特征

6、較明顯,CD11c、CD80、CD86及MHCⅡ的表達水平也較高,細胞凋亡指數(shù)較低,混合淋巴細胞反應和分泌IL-4、IL-12 p70能力較強,Smad6干擾組DC形態(tài)成熟特征不明顯,CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ的表達水平較低,細胞凋亡指數(shù)較高,混合淋巴細胞反應和分泌IL-4、IL-12 p70能力較弱。
　　 結(jié)論:在小鼠BMDC中Smad6基因被抑制并有TGF-β1刺激的情況下,細胞多呈未成熟狀態(tài),以未成熟的生物