小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的制備及其對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用研究.pdf

1、目的:胃癌是全球腫瘤相關(guān)死亡的主要因?yàn)橹?是我國(guó)常見的惡性腫瘤,占消化道腫瘤的50％～60％,嚴(yán)重危害著人類的健康,目前對(duì)胃癌的治療仍是以手術(shù)為主,輔以放、化療的綜合治療,雖然療效較過(guò)去有了很大的改善,但總體效果仍不能令人滿意。隨著現(xiàn)代腫瘤免疫生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展,腫瘤免疫治療中樹突狀細(xì)胞的作用成為研究的熱點(diǎn)。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原呈提細(xì)胞(antigen-presenti

2、ng cell,APC),參與抗原的捕捉、加工、處理和提呈,成熟的DC是唯一能激活幼稚T淋巴細(xì)胞(na(i)ve T cell)的抗原呈提細(xì)胞,在誘導(dǎo)高效而特異的抗腫瘤細(xì)胞免疫中起關(guān)鍵作用。
　　 DC雖然廣泛分布于機(jī)體所有組織器官中,但在外周血中含量極少,僅占單核細(xì)胞總數(shù)的0.1％-10％,分離純化困難,不能滿足基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的需要,大量擴(kuò)增高純度DC是其研究的關(guān)鍵。為獲得足夠治療量的樹突狀細(xì)胞,近年來(lái),開展了體外多種不同

3、前體細(xì)胞沿不同分化途徑誘導(dǎo)擴(kuò)增DC的研究,包括用人臍血、骨髓和粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員后外周血中的造血干/祖細(xì)胞或單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增,已獲得成功。由于樹突狀細(xì)胞主要來(lái)源于骨髓的CD34+造血干細(xì)胞,故從骨髓細(xì)胞中分離擴(kuò)增誘導(dǎo)DC更易成功。本研究就小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(bone marrow-deftveddendritic cell,BMDC)制備的相關(guān)流程、添加GM-CSF、IL-4、TNF-α的劑量、時(shí)機(jī)、孵育時(shí)間等進(jìn)行探究,探索、優(yōu)

4、化體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增小鼠樹突狀細(xì)胞的方法,通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞儀行相對(duì)特異性表面標(biāo)志物檢測(cè)以鑒定DC的成熟情況,摸索和印證DC體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法,提高DC的產(chǎn)量和純度。
　　 DC除了通過(guò)特異性腫瘤單克隆抗體(McAb)介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng),增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的活性,激活并調(diào)控T淋巴細(xì)胞的免疫功能,對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用外,還具有直接殺傷腫瘤的生物學(xué)活性。過(guò)去多采用同位素法、染料排斥法及乳酸脫氫酶(LDH)釋放法等方法檢測(cè)

5、DC抗腫瘤細(xì)胞的活性,這些方法雖各具優(yōu)點(diǎn),但都存在一定的局限性,本研究采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測(cè)定小鼠DC在不同孵育時(shí)間、不同效靶比(E:T)時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞的體外殺傷作用。探討樹突狀細(xì)胞腫瘤免疫機(jī)制,為臨床進(jìn)一步研究與應(yīng)用DC進(jìn)行胃癌的免疫治療提供佐證。
　　 方法:
　　 選取四周齡615小鼠,雌雄各半,處死,無(wú)菌條件下收集并純化骨髓細(xì)胞,應(yīng)用小鼠GM-CSF和小鼠IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓細(xì)胞,于第8天加入小鼠TN

6、F-α培養(yǎng)24小時(shí),倒置顯微鏡觀察第1、3、5、7、8、10天DC的形態(tài)、大小、數(shù)量、分布及貼壁情況的變化。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)第7天、第10天DC表面標(biāo)志物CD11c、DC86分子的表達(dá)。
　　 將培養(yǎng)11天的樹突狀細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)12小時(shí)的615小鼠胃癌細(xì)胞中,DC與胃癌細(xì)胞共孵育作為實(shí)驗(yàn)組,其效靶比分別為10:1、20:1、30:1；對(duì)照組分別單獨(dú)加入胃癌細(xì)胞、DC和1640培養(yǎng)液。用MTT比色法分別測(cè)共孵育24小時(shí)、48

7、小時(shí)的OD值,計(jì)算DC對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性。
　　 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x2檢驗(yàn),p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1 DC的制備
　　 每只615小鼠能分離出約3×107個(gè)骨髓細(xì)胞,培養(yǎng)第2天,相差顯微鏡下可見到培養(yǎng)板底部有半貼壁細(xì)胞,少量細(xì)胞集落形成,簇狀生長(zhǎng),細(xì)胞體積小,圓形,細(xì)胞無(wú)明顯突起,大量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),有細(xì)胞聚集現(xiàn)象。在細(xì)胞因子的刺

8、激作用下這些細(xì)胞逐漸增殖,并且胞體逐漸增大,表面顯示出不規(guī)則的突起,但貼壁能力相對(duì)下降,換液時(shí)輕微的吹打便可使其懸浮。培養(yǎng)第6天,較多細(xì)胞呈半懸浮生長(zhǎng),可見大量細(xì)胞集落形成,集落部分細(xì)胞表面出現(xiàn)毛刺樣突起,并可見少量單個(gè)懸浮的典型DC。培養(yǎng)第7天,細(xì)胞集落變大,細(xì)胞體積增大,周邊刺突明顯,突起粗大、明顯,細(xì)胞形態(tài)似星形或梭形。加入TNF-α48小時(shí)后絕大部分細(xì)胞懸浮,表面顯示出明顯的樹枝狀突起。經(jīng)計(jì)數(shù),1只小鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)

9、10d后DC的產(chǎn)量約為7×106。
　　 2 DC標(biāo)志物檢測(cè)
　　 分別收集加入TNF-α前及加入TNF-α48小時(shí)后的DC懸液,加入FITC anti-mouse CD11c、PE anti-mouse CD86單抗,避光孵育后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組DC表面CD11c、CD86的表達(dá)情況,將加入TNF-α前后組作為實(shí)驗(yàn)組,將未加抗體的DC作為對(duì)照組,結(jié)果顯示,CD11c陽(yáng)性表達(dá)率加入TNF-α前為:65.09±3.04％

10、,加入TNF-α后為:70.99±1.44％(x2=6.625;p=0.097)；CD86陽(yáng)性表達(dá)率加入TNF-α前為25.80±30％,加入TNF-α后為55.91±2.41％(x2=6.856；p=0.032),CD86陽(yáng)性表達(dá)率加入TNF-α前較加入后高,二者比較差異有顯著性(p<0.05),CD11c的陽(yáng)性表達(dá)率加入TNF-α前后無(wú)差別(p>0.05)。
　　 3 DC對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性檢測(cè)
　　 成熟DC與6

11、15小鼠胃癌細(xì)胞共孵育24小時(shí),用MTT法檢測(cè)DC在效靶比分別為10:1、20:1、30:1時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性分別為:22.62±2.94％、45.75±1.48％、74.24±0.34％,三組之間比較DC對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性有顯著性(x2=13.997；p=0.036),并隨效靶比的增高而增高；共孵育48小時(shí)DC對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性分別為:28.32±3.27％、50.77±0.53％、79.90±2.65％,三組之間比較DC的殺

12、傷活性有顯著差別(x2=13.420；p=0.037)；共孵育24小時(shí)各組與48小時(shí)各等效靶比組間比較無(wú)差別。對(duì)照組中DC、胃癌細(xì)胞、1640培養(yǎng)液之間比較差異無(wú)顯著性(p>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1提取純化小鼠骨髓細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4、TNF-α的刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的DC,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞儀表面標(biāo)志物檢測(cè),證實(shí)數(shù)量較大、純度較高,此方法穩(wěn)定可靠。
　　 2 MTT比色法測(cè)不同效靶比、