N-酰基高絲氨酸內酯酶AidE的初步晶體學研究.pdf

1、在一些革蘭氏陰性病原菌如綠膿假單胞菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌中，毒力因子產生、生物膜形成、生物發(fā)光、抗生素合成、粘附、群游現象、孢子形成等行為與群體感應系統(tǒng)有著密切的聯系。群體感應參與微生物分泌特定分子如自體誘導劑來調節(jié)種內和種間密度。介導細胞間通路的小分子的結構是多樣的，其中一大類信號分子由Ⅳ-?；呓z氨酸內酯(AHLs)組成。群體感應系統(tǒng)以可擴散的N-酰基高絲氨酸內酯作為細胞間信號傳遞分子，AHL的濃度在調節(jié)病原細菌的毒力基因表達和相關

2、重要生物功能上發(fā)揮著關鍵作用。一些生物含有編碼AHL內酯酶的基因，編碼的內酯酶可破壞AHLs的內酯環(huán)，從而阻斷群體感應系統(tǒng)。
　　AidE是一種來源于蒼白桿菌屬的AHL內酯酶，目前沒有關于AidE結構與功能方面的報道。本研究運用分子生物學技術構建AidE重組蛋白，過表達、運用Ni親和層析、凝膠過濾層析和離子交換層析進行蛋白樣品的純化和制各，獲得電荷均一、分子量大小以及聚體形式均一的AidE蛋白。進一步通過優(yōu)化Ni親和層析、凝膠過濾

3、層析和離子交換層析的純化步驟，獲得兩相均一的硒代AidE蛋白。AidE是一種對AHL酰胺鏈長度和C3位取代基具有底物寬泛性的鋅離子依賴型AHL內酯酶。一級序列比對分析表明，AidE與其它已知的AHL內酯酶的同源度小于25％。根據該系統(tǒng)進化樹的拓撲結構，AidE屬于金屬-β-內酰胺酶家族，為金屬依賴蛋白，含有金屬結合基序“HXHXDH”。運用坐滴法和懸滴法對AidE蛋白進行晶體生長條件的篩選，獲得最初微晶生長條件，最終在1.575 M a

4、mmoniumsulfate，0.1 M sodium cacodylate trihydrate pH6.6，0.01 M cobalt(Ⅱ) chloride條件下獲得了AidE的單晶，并收集衍射數據。運用衍射數據處理軟件HKL2000處理得到AidE初步晶體學數據。AidE蛋白晶體屬于正交晶系，空間群為P2221。在其結構解析的過程中，由于AidE晶胞的一個不對稱單位里存在10個分子，因此不能用分子置換法進行求解，而必須用實驗相角