玉米絲氨酸消旋酶的重組表達(dá)、純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、絲氨酸消旋酶（serine racemase，SR）是一個(gè)雙功能酶，同時(shí)具有消旋酶和脫水酶活性，可以將L-/D-絲氨酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-/L-絲氨酸；還可以將L-/D-絲氨酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸。已研究了擬南芥、大麥和水稻SR的酶學(xué)性質(zhì)，但是重組蛋白的C 端都含有組氨酸標(biāo)簽。在數(shù)種植物中，玉米對(duì)外源D-絲氨酸的耐受性最高，但其分子機(jī)制尚不清楚，為此，本文研究了不同標(biāo)簽對(duì)重組玉米SR的各種活性的影響，分析了重組蛋白轉(zhuǎn)化D-絲氨酸的活性，嘗試?yán)糜衩?/p>

2、SR作為篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)化煙草，獲得如下結(jié)果：
　　 1．克隆并分析了玉米絲氨酸消旋酶編碼基因。從NCBI中搜索到與大麥SR 高度同源的玉米SR預(yù)測(cè)基因NM_001143028.1，利用RT-PCR的方法，從玉米幼葉中克隆該編碼基因。從核苷酸序列推定的氨基酸序列比對(duì)顯示玉米基因編碼與登陸的不同植物SR，包括大麥（BAF63026.1），水稻（NP_001053521.1），高粱（AAT42169.1）和擬南芥（XP_002872605

3、.1）的相似性分別為87％，91％，94％和69％，表明它與禾本科單子葉植物SR的同源性高，與擬南芥同源性低。
　　 2．表達(dá)和純化了玉米SR。不同表達(dá)載體中的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示，SR編碼基因插入pET28-TEV中，誘導(dǎo)表達(dá)His-SR后，TEV酶切除His-tag標(biāo)簽的效果最好。純化的His-SR和SR 亞基分子量分別為38kDa和36kDa。蛋白的表達(dá)量分別為2.5mg/ml和1.93mg/ml。
　　 3．帶標(biāo)簽和

4、不帶標(biāo)簽玉米SR的活性分析。結(jié)果表明，無(wú)標(biāo)簽的SR 活性最高。C端His-tag明顯降低脫水酶活性，但對(duì)消旋酶活性抑制較??；N端His-tag對(duì)絲氨酸消旋酶活性和脫水酶活性比N端標(biāo)簽的抑制效果不明顯。
　　 4．分析了SR的脫水酶酶學(xué)性質(zhì)。反應(yīng)的最適溫度是37 ℃，最適pH為8.8，在Mn2+存在的條件下活性最大SR的Km值是12.5mM，Vmax值是8.4nmol/min/mg。
　　 5．SR作為篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)化煙草。在