重組N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙酰基酶包涵體的體外復(fù)性研究.pdf

1、N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙?；?NAOase)是一種重要的用于手性拆分的酶，具有廣泛的底物選擇性，常用于多種活性氨基酸的酶法拆分。本論文針對(duì)由大腸桿菌argE基因編碼在重組菌表達(dá)的重組NAO大多以無(wú)活性的包涵體存在的問(wèn)題，采用多種復(fù)性方法實(shí)現(xiàn)重組N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙酰基酶復(fù)性。研究主要內(nèi)容包括：
　　 (1)重組N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙?；赴w變性條件：比較了Triton X-100、乙二胺四乙酸鈉(EDTA)和低濃度的變性劑等幾種常用的

2、洗滌劑，發(fā)現(xiàn)TritonX-100和尿素聯(lián)合洗滌的方法最好，最后確定最佳洗滌液成分為：4mol/L Urea，0.5％ Triton X-100，Imol/L NaCL，0.05mol/L Tris-HCL，pH為7.9，用此法可以大部分的去除雜蛋白?？疾炝巳芙庖焊鞣N成分對(duì)溶解效果的影響，確定最優(yōu)溶解液成分為：8mol/L尿素、15mmol/Lβ-巰基乙醇、50mmol/L Tris-HCL，pH為8.5，此時(shí)溶解液能最有效的溶解該包涵

3、體。在最優(yōu)狀態(tài)下，對(duì)重組NAO包涵體的溶解工藝也進(jìn)行了一定研究，研究發(fā)現(xiàn)，將1g重組NAO包涵體溶于10mL溶解液中，溶解5小時(shí)，此時(shí)溶解效果最好。
　　 (2)重組N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙?；赴w稀釋復(fù)性：采用稀釋復(fù)性法研究了重組N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙酰基酶(NAO)包涵體的復(fù)性條件，如蛋白濃度、復(fù)性液中尿素濃度、pH值、GSH濃度及GSH/GSSG比例，同時(shí)對(duì)稀釋操作方式進(jìn)行了考察，得到了較為適宜的復(fù)性條件。結(jié)果表明，尿素能有效抑

4、制復(fù)性過(guò)程中蛋白質(zhì)的聚集，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，復(fù)性效果變差。當(dāng)復(fù)性緩沖液中尿素濃度為2 mol/L，GSH濃度為5mmol/L，GSH/GSSG為2.5，pH為8.5，在4℃下進(jìn)行分批稀釋復(fù)性操作，復(fù)性后重組N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙?；傅幕钚詾?.077U/mL，比酶活達(dá)到14.943 U/mg，與可溶性表達(dá)的NAO比較復(fù)性率達(dá)到21.48％。
　　 (3)重組N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙?；赴w稀釋復(fù)性動(dòng)力學(xué)的研究：在蛋白質(zhì)變性－復(fù)性

5、三態(tài)模型的基礎(chǔ)上，對(duì)重組NAO包涵體稀釋復(fù)性的動(dòng)力學(xué)過(guò)程以及添加L-Arg和人工分子伴侶對(duì)復(fù)性過(guò)程的影響進(jìn)行了研究。研究表明，三態(tài)模型可以很好地描述NAO的稀釋復(fù)性過(guò)程，NAO在復(fù)性過(guò)程中有形成二分子聚集體的趨勢(shì)。添加小分子復(fù)性劑L-Arg不僅有助于活性態(tài)酶的形成，同時(shí)對(duì)聚集體的形成也起到了抑制作用。通過(guò)人工分子伴侶輔助復(fù)性可以較好地抑制NAO的分子間聚集，但對(duì)活性態(tài)酶的形成沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示稀釋復(fù)性后比酶活為14.048 U

6、·mg-1，復(fù)性收率為20.202％；添加L-Arg復(fù)性后比酶活達(dá)到21.273U·mg-1，復(fù)性收率達(dá)到30.591％；人工分子伴侶輔助復(fù)性后比酶活達(dá)到23.082U·mg-1，復(fù)性收率達(dá)到33.192％。
　　 (4)重組N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙?；赴w柱上復(fù)性的研究：用DEAESepharose Fast Flow層析柱和三緩沖體系作為復(fù)性系統(tǒng)對(duì)重組N-乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙?；赴w進(jìn)行復(fù)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，4 mol/L Ure