人脈絡膜黑色素瘤腫瘤干細胞生物學特性研究.pdf

1、脈絡膜惡性黑色素瘤(choroidal melanoma，CM)是成年人最常見的眼內原發(fā)惡性腫瘤之一。CM惡性程度高，可侵及單眼和雙眼，對視力損害極大，并可危及生命。脈絡膜黑色素瘤傳統(tǒng)治療方法是眼球摘除術，近年來，隨著早期準確診斷和及時治療病例的增加以及新技術的應用，在發(fā)達國家，眼球摘除術已經較少應用；更多地是根據(jù)腫瘤的大小、位置和范圍以及分類、分別提出了光凝治療、冷凍治療、鞏膜板放療、溫熱治療、眼球摘除、眼內容剜除等相對適應癥和綜合治

2、療等，大大提高了治療效果。而在我國，眼球摘除仍是主要的治療方法，為保住患眼，其他的治療方法已越來越多地被關注，但腫瘤的復發(fā)和轉移是其主要問題。因此對CM發(fā)病機制、早期診斷及治療的研究一直是腫瘤學家及眼科工作者要攻克的重點和難點，并具有非常重要的現(xiàn)實意義。 體外研究顯示，腫瘤內的腫瘤干細胞具有維持腫瘤無限增殖以及藥物抗性的作用。因此腫瘤對化療藥物容易形成耐藥，直接影響治療效果。在我院的病例中，曾有使用深低溫冷凍治療視網膜母細胞瘤患

3、者，治療后視網膜母細胞瘤退變消失，患者的視力保持良好。在腫瘤治療領域中，深低溫冷凍治療也顯示了很好的治療前景。 為了驗證脈絡膜黑色素瘤中存在腫瘤干細胞，并明確深低溫冷凍對腫瘤干細胞的作用，及引起腫瘤細胞退變消失的機制，我們進行了脈絡膜黑色素瘤中腫瘤干細胞(choroidal melanomastemcell,CMSC)的分離培養(yǎng)，研究其生物學特性。在分離純化成功后，進一步研究深低溫凍融對腫瘤干細胞的殺傷作用，以及引起腫瘤細胞退變

4、的機制，為脈絡膜黑色素瘤的臨床治療提供新思路。 1.研究目的： 通過對OCM-1細胞中腫瘤干細胞的分離培養(yǎng)，驗證脈絡膜黑色素瘤中存在著腫瘤干細胞，進一步純化腫瘤干細胞后，研究其生物學特性。利用深低溫反復凍融對腫瘤干細胞進行殺傷，觀察殺傷作用，并分析殺傷的可能機制。 2.實驗方法： 使用無血清化學限定培養(yǎng)基(serum-free medium，SFM)，分離純化培養(yǎng)腫瘤干細胞，觀察細胞生長的變化。使用CD1

5、33，Musashi-1免疫細胞染色，誘導分化，動物實驗研究腫瘤干細胞的生物學特性。 深低溫反復凍融腫瘤細胞和腫瘤干細胞后，MTT法，克隆實驗檢測細胞抑制情況，HE染色，電鏡觀察細胞形態(tài)學變化。 使用P16，Hoechst 33342免疫細胞化學染色，流式細胞儀檢測CD40及細胞膜電位的變化，并使用共聚焦顯微鏡觀察細胞內鈣離子的變化。 3.結果： 3.1用SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細胞均為懸浮團狀集落生長，呈現(xiàn)

6、典型的干細胞生長方式，CD133,Musashi-1陽性表達，并可以分化為HMB45，GFAP，S100，NSE陽性的細胞。1×105個CMSC細胞就可以在Balb/c裸小鼠體內成瘤，而注射1×105個OCM-1細胞的Balb/c裸小鼠均未成瘤。 3.2凍融后OCM-1細胞出現(xiàn)大量的凋亡細胞，而CMSC則以壞死為主，凋亡細胞少見。電鏡下觀察到冰晶的結構特征。 3.3激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，凍融次數(shù)的增加，OCM-1細胞

7、凋亡率增高。0.5×3組凋亡細胞最多，達到51％。流式細胞儀測定顯示凍融后細胞膜電位下降，凍融前后CD40陽性細胞比率差異明顯，且呈一定的量效關系。共聚焦顯微鏡觀察到凍融后細胞發(fā)生較高比例的凋亡，細胞內鈣離子濃度隨著細胞凋亡比率的增高而升高，Western blot檢測顯示細胞凍融后survivin蛋白表達增加。 4.結論： 4.1脈絡膜黑色素細胞中存在腫瘤干細胞，腫瘤干細胞具有分化和增殖的能力，且表現(xiàn)出更強的致瘤性。