醫(yī)學專業(yè)畢業(yè)論文外文翻譯

1、<p>　　中華鋸齒米蝦(Neocaridina denticulata sinensis)卵黃蛋白合成雙源性分析</p><p>　　cDNA Cloning and Expressive Characterization of</p><p>　　Vitellogenin in Neocaridina denticulata sinensis</p><p

2、>　　摘要：卵黃蛋白原（Vitellogenin，Vg）是廣泛地存在于卵生脊椎和無脊椎動物體內(nèi)的雌性特異性蛋白，是卵黃蛋白（vitellin，Vn）的前體，本文通過同源克隆的方法從成熟中華鋸齒米蝦的卵巢中克隆到了一條長474 bp的Vg cDNA序列。并根據(jù)此序列設計了DNA探針，之后提取中華鋸齒米蝦卵巢的不同發(fā)育期，分別提取卵巢和肝胰腺的總RNA,用RT-PCR方法進行半定量實驗，探討不同卵巢發(fā)育時期卵巢與肝胰腺在Vg表達中所發(fā)

3、揮的作用，同時通過免疫組織化學方法，對中華鋸齒米蝦的Vn發(fā)生過程進行了觀察。結(jié)果表明，卵巢與肝胰腺均為Vg合成部位，在卵巢發(fā)育前期與中期肝胰腺為主要合成部位，后期卵巢為主要合成部位。卵巢中內(nèi)源性卵黃物質(zhì)發(fā)生的主要場所是卵母細胞質(zhì)，而肝胰腺是外源性卵黃物質(zhì)來源的主要場所。無組化免疫結(jié)果.</p><p>　　Abstract: Vitellogenin (Vitellogenin, Vg) is widely pr

4、esent in oviparous vertebrates and invertebrates, it’s female-specific protein, vitellin’s (vitellin, Vn) precursors. a sequence of 474 bp of the Vg cDNA was got using this method of homology cloning from a mature Neocar

5、idina denticulata sinensis. The DNA probes was designed based on this sequence, then collected the Neocaridina denticulata sinensis ovaries at different developmental periods, extracted the total RNA from ovaries and hep

6、atopan</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　中華鋸齒米蝦具有廣鹽、廣溫性，繁殖力快，生命力強等特點，使其成為生態(tài)、生理和毒理等實驗的良好材料。并且由于中華鋸齒米蝦產(chǎn)量大，有一定的經(jīng)濟價值。 Vitellogenin這個名稱最初由Pan[]等人在1969年提出，指雌性昆蟲血液淋巴蛋白，后來這一名稱被廣泛用于特指雌性動物血漿中的卵黃蛋白原，

7、而卵黃蛋白原是卵黃蛋白的前體。蝦類在未開口時期，其胚胎仔體發(fā)育、生長需要的能量和營養(yǎng)完全依賴卵黃，而卵黃的主要成分是Vn，因此Vn的數(shù)量和質(zhì)量對于維持蝦類早期的生命至關重要[]。同時Vg還具有蛋白載體與受體的作用[]。動物的Vg按來源不同可以分為內(nèi)源性Vg和外源性Vg兩種，前者由卵子本身通過卵內(nèi)合成而產(chǎn)生；后者則由卵子外其他細胞、組織或器官通過卵外合成以后再轉(zhuǎn)入卵子內(nèi)。本文使用同源克隆的方法克隆了中華鋸齒米蝦卵黃蛋白原cDNA部分片段，

8、并根據(jù)得到的中華鋸齒米蝦Vg cDNA部分片段設計引物作為探針，利用PT-PCR的方法對Vg的表達部位與各個時期的表達情況做了一個探討，在制備抗體的基礎上利用免疫組織化學方法，對中華鋸齒米蝦的Vn發(fā)生過程進行了觀察，本文旨在探明中華鋸齒米蝦Vn的發(fā)生規(guī)律，為研究其繁</p><p>　　Neocaridina denticulata sinensis fertility quickly, vitality and

9、 strong features,live in wide salinity and temperature, making it become a good material of the ecology, physiology and toxicological experiments. And there is a certain economic value. Vitellogenin ,this name was origin

10、ally from the Pan and others in 1969, refers to the blood lymph protein of the female insects, then the name is widely used in specific to female animals’ Vitellogenin in blood, vitellin is the former body of Vitello<

11、/p><p><b>　　材料和方法</b></p><p><b>　　材料與試劑</b></p><p><b>　　材料</b></p><p>　　實驗所用中華鋸齒米蝦產(chǎn)自河北省安新縣白洋淀，實驗室飼養(yǎng)[]。</p><p><b>　　菌

12、種和試劑　</b></p><p>　　E.coli DH5α由本實驗室保存;pMD19-T載體，RNAiso? Plus，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，Ex Taq酶購自Takara公司，DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒為天根時代(北京)公司產(chǎn)品。弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑，1 mg/mL BSA溶液。1%甲苯胺藍染液，0.05 mol/L P

13、BS緩沖液（pH7.4），2.5%戊二醛—4%多聚甲醛（pH7.4），丙酮，Epon812環(huán)氧樹脂，1%醋酸甲醇液，50%醋酸甲醇液，3%H2O2溶液，0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH6.0），HRP（辣根過氧化物酶）標記的羊抗鼠抗血清，DAB顯色液。</p><p>　　E.coli DH5α by the laboratory-preserved; pMD19-T vector, RNAiso ? Plus

14、, PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit, Ex Taq enzyme were purchased from Takara Company, DNA gel extraction kit from TianGen (Beijing)Company. Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, 1

15、mg / mL BSA solution. 1% Toluidine blue stain, 0.05 mol / L PBS buffer (pH7.4), 2.5% glutaraldehyde -4% paraformaldehyde (pH7.4), acetone, Epon812 epoxy resin, 1% acetic acid methanol solution , 50% acetic acid methano&l

16、t;/p><p><b>　　方法</b></p><p>　　卵黃蛋白原部分序列的克隆</p><p><b>　　卵巢總RNA的提取</b></p><p>　　使用RNAiso? Plus進行卵巢總RNA的提取，使用DNase I去除基因組污染，之后使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行RNA完整性的檢測，并

17、使用紫外分光光度計確定濃度和純度。</p><p>　　Using RNAiso ? Plus extract ovarian total RNA, using DNase I to remove genomic contamination, then using 1% agarose gel electrophoresis detect the integrity of RNA, and use the UV

18、spectrophotometer to determine concentration and purity.</p><p><b>　　引物的設計</b></p><p>　　從GenBank (http: //www. ncbi nlm. nih. gov )查詢到與米蝦親緣關系可能較近的羅氏沼蝦（BAB69831.1）Vg蛋白序列之后使用NCBI中的BLAS

19、Tp系統(tǒng)進行蛋白序列保守性比對查詢，得到以下蛋白保守性較高：短溝對蝦（Penaeus semisulcatus）（AAL12620.3）[]，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）（AAP76571.2），日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）（BAD98732.1），明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）（ABC86571），刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）（ A

20、AN40700.1）[]，美洲螯龍蝦（Homarus americanus）（ABO09863.1），高背長額蝦（BAD11098.1）。之后使用BLASTn查找凡納濱對蝦（AY321153.2）[]、短溝對蝦（DQ288843.1）[]、日本囊對蝦（AB033719.1）[]、刀額新對蝦（AF548364.1）、美洲鰲龍蝦（EF422415.1）、羅氏沼蝦（AB056</p><p>　　Search from

21、 GenBank (http://www. Ncbi nlm. Nih. Gov), Neocaridina denticulata sinensis may be closer kinship to rosenbergii (BAB69831.1),after get its Vg protein sequence using the term BLASTp-protein sequence conservative systems

22、 of NCBI, get the following proteins conservative higher: Penaeus semisulcatus (Penaeus semisulcatus) (AAL12620.3) , Litopenaeus vannamei (Litopenaeus vannamei) (AAP76571.2), Japan Marsupenaeus (Marsupenaeus japonicus) (

23、BAD98732.1), Ming shrimp (Fenneropenaeus chinensi</p><p>　　RT-PCR和克隆測序　</p><p>　　以中華鋸齒米蝦成熟卵巢總RNA為模板, 使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄。反應條件:總RNA模板1 μg,10 μmol·L-1的Oligo(dT

24、)15 1 μL,65℃保溫10 min，之后在體系中加入5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液5 μL，5 mmol·L-1的dNTP 2.5 μL，RNase inhibitor 2 U,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶5 U,無RNase水補足體積20 μL。42℃溫育1 h。合成的cDNA直接作為PCR反應的模板。進行PCR反應的體系如表1所示：</p><p>　　Total RNA of Neocaridina de

25、nticulata sinensis mature ovary as a template, use the PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit for reverse transcription. Reaction conditions: total RNA template 1 μg, 10 μmol · L-1 to Oligo (dT) 15 1 μL, 65 ℃

26、keep 10 min, then adding 5 × reverse transcription buffer 5 μL , 5 mmol · L-1 The dNTP 2.5 μL, RNase inhibitor 2 U, M-MLV reverse transcriptase 5 U, non RNase water-filled volume of 20 μL. 42 ℃ incubation 1 h.

27、Using cDNA of synthesis directly as PCR template</p><p><b>　　表1 PCR體系</b></p><p>　　Table 1 PCR System</p><p>　　反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火40 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)，72℃最后

28、延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE(pH 8.0) ,電壓為5 V/cm ,EB染色,于凝膠成像系統(tǒng)下切膠回收純化預期片段，連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。采用PCR擴增法篩選陽性克隆，送北京三博遠志生物技術有限公司由3730測序儀測定DNA序列。之后使用DNAMAN將得到的序列與羅氏沼蝦及高背長額蝦Vg mRNA序列進行序列比對，確定是否為部分Vg c

29、DNA序列。比對使用DNAMAN默認參數(shù)。</p><p>　　Reaction conditions: 95 ℃ pre-denaturation 5 min; 94 ℃ denaturation 45 s, 55 ℃ annealing 40 s, 72 ℃ extension 60 s, 35 cycles, 72 ℃ final extension of 10 min. PCR products thro

30、ugh 1.0% agarose gel electrophoresis, electrophoresis buffer for 0.5 × TBE (pH 8.0), voltage of 5 V / cm, EB staining, in gel imaging system,cut down the recycling purified expected fragments, connected to the pMD19

31、-T vector, transformed E.coli DH5α strain. Screened using PCR amplification of positive clones, to send Beiji</p><p>　　Vg基因表達特征的研究</p><p><b>　　卵巢總RNA的提取</b></p><p>　　使用R

32、NAiso? Plus進行卵巢發(fā)育Ⅱ期，卵巢發(fā)育Ⅲ期與卵巢發(fā)育Ⅴ期的雌性中華鋸齒米蝦的卵巢，肝胰腺，肌肉組織[]總RNA的提取，使用DNase I去除基因組污染，使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行RNA完整性的檢測，并使用紫外分光光度計確定濃度和純度。</p><p>　　Using RNAiso ? Plus to extract total RNA of liver and pancreas and muscle t

33、issues at ovarian’development of stage Ⅱ, stage Ⅲ and Ⅴ period of female Neocaridina denticulata sinensis, use DNase I to remove genomic contamination, used 1% agarose gel electrophoresis to detect RNA integrity, and use

34、 the UV spectrophotometer to determine its concentration and purity?</p><p>　　引物的設計與RT-PCR　</p><p>　　根據(jù)測序得到的中華鋸齒米蝦的Vg的部分cDNA序列設計特異性引物MXF：5’- CACTCCTCCCATAATCCACAG -3’，MXR: 5’-TACCCATAAGACCTGCCAC

35、AT-3’，預期產(chǎn)物為224 bp，Tm=57.1℃，同時根據(jù)Genbank登錄的其他蝦類的β-actin mRNA序列設計1對引物actF：5'-GTGTGATGGTTGGTATGGGT-3'和actR：5'- ATGAGGTAATCGGTCAA GTC -3', 擴增內(nèi)標基因β-actin片段,預計長度為445 bp，Tm=52℃，引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成。將所提取的各組織RNA反轉(zhuǎn)錄得

36、到第1鏈cDNA作為模版。PCR體系如表1所示。mxF與mxR的反應條件為:95 ℃預變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火45 s，72℃延伸30 s，32個循環(huán);72℃最后延伸10 min；4℃保溫。actF與actR的反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，52℃退火45 s，72℃延伸40 s，28個循環(huán)；72℃最后延伸10 min；4℃保溫。</p><p>　　Accordin

37、g to part of the Neocaridina denticulata sinensis’s Vg cDNA sequences,designed the specific primers MXF: 5'-CACTCCTCCCATAATCCACAG -3 ', MXR: 5'-TACCCATAAGACCTGCCACAT-3', expected product of 224 bp, Tm = 5

38、7.1 ℃, According to Genbank date-base about other Shrimps’ β-actin mRNA sequences,designed a pair of primers actF: 5'-GTGTGATGGTTGGTATGGGT-3'and actR：5'- ATGAGGTAATCGGTCAA GTC -3', Amplified internal stan

39、dard gene β-actin fragment and estimated length of 445 bp, Tm = 52 ℃, primer synthes</p><p><b>　　3）結(jié)果分析</b></p><p>　　將相同模版，使用mxF/mxR所得產(chǎn)物4μL，actF/actR所得產(chǎn)物3 μL進行混合，使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。之后使用

40、quantity one軟件進行電泳條帶的灰度測定，用目的條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值的比值來表示Vg表達量的高低。</p><p>　　The same template, using mxF / mxR ，got products 4μL, using actF / actR got products 3 μL ,mix them, used 1% agarose gel electrophoresis f

41、or detection. After electrophoresis, used software of quantity one to determine the gray stripe, the ratio of the purpose gray value and restricted reference band gray values is represent the level of Vg expression.</

42、p><p>　　中華鋸齒米蝦卵巢Vn免疫組化研究</p><p><b>　　抗體的制備</b></p><p>　　根據(jù)柳峰松等[2]提純中國對蝦Vn的方法純化中華鋸齒蝦成熟卵巢中的Vn，之后取純化后的Vn對小鼠進行免疫，第一次免疫后隔10 d進行第1次加強免疫，每只小鼠腹腔注射1 mL抗原乳化液與福氏不完全佐劑等體積混合。此后，每隔7 d，每只

43、小鼠再腹腔注射0.5 mL抗原（不加佐劑）。于最后一次免疫后4 d從小鼠尾部斷尾取血測效價。將小白鼠氯仿麻醉后用酒精棉球擦拭其尾部，斷尾取血，收集血液0.3 mL。血液4℃下3 000 r/min，離心15 min，收集上清液即為抗血清。</p><p>　　According to Liu Feng-Song et al method of purification of the Chinese shrimp

44、Vn purified Neocaridina denticulata sinensis the Vn of mature ovary, then used the purified Vn to do mice immunization, the first compartment 10 d after immunization for the first time a strengthening of immunization, ea

45、ch mice were injected intraperitoneally with the maxture of 1 mL antigen-emulsion and Freund's incomplete adjuvant in equal volumes. Since then, every 7 d, each mouse was injected intraperitoneally with</p>&l

46、t;p><b>　　免疫組化標本的制備</b></p><p>　　在0～4 ℃，解剖米蝦雌性個體的卵巢，于0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液pH 7.4中各切成1 mm3的小塊兒，立即置于裝有適量預冷的2.5%戊二醛—4%多聚甲醛（pH7.4）固定液中3～4 h。 經(jīng)過酒精系列脫水，使用環(huán)氧樹脂Epon812進行包埋，之后進行半薄切片（1.5 μm）。</p><

47、p>　　At the temprature 0 ~ 4 ℃, anatomize the ovary of female shrimp, cut it into 1 mm3 small pieces in 0.2 mol / L phosphate buffer at pH 7.4 and immediately placed it in an appropriate pre-cooling 2.5% glutaraldehyde

48、 -4% paraformaldehyde (pH7.4) stationary liquid 3 ~ 4 h. After alcohol dehydrating at series of different concentration, used epoxy resin Epon812 for embedding, then do semithin section (1.5 μm).</p><p><

49、;b>　　免疫組化實驗步驟</b></p><p>　　首先使用工作液（氫氧化鉀 2 g+環(huán)氧丙烷 5 ml+甲醇 10 ml）處理5 min，1%醋酸甲醇液處理1 min，50%醋酸甲醇液處理5 min進行樣品脫脂。之后使用0.05 mol/LPBS緩沖液（pH7.4）浸洗3次，每次5 min，3% H2O2溶液浸泡20 min抑制內(nèi)源性過氧化物酶，0.05mol/L PBS緩沖液（pH7.4

50、）浸洗3次，每次5 min。在100℃的條件下，用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH6.0）處理樣品15～20 min進行抗原修復，之后自然冷卻到室溫[86-90]。用羊血清（1:10稀釋）處理樣品30 min進行封閉。0.05 mol/L PBS緩沖液（pH7.4）浸洗3次，每次5 min。在室溫條件下，用抗血清（1:20稀釋）處理樣品2 h進行一抗孵育。0.05 mol/L PBS緩沖液（pH7.4）浸洗3次，每次5 min。在室

51、溫條件下，用HRP標記的羊抗鼠抗血清（1:1000）處理樣品1～1.5 h進行二抗孵育。0.05 mol/L PBS緩沖液（pH7.4）浸洗3次，每次5 min。最后DAB顯色液處理樣品5 min進行顯色，雙蒸水沖洗干</p><p>　　First used working solution (potassium hydroxide 2 g + propylene oxide 5 ml + methanol,

52、10 ml) to soak 5 min, 1% acetic acid methanol solution treat for 1 min, used 50% acetic acid methanol solution to treat samples 5 min for degreasing. Then used 0.05 mol/L PBS buffer (pH7.4) to dip 3 times, each time 5 mi

53、n, soaked in 3% H2O2 solution 20 min to inhibi the endogenous peroxidase, in 0.05mol / L PBS buffer (pH7.4 ) diped three times, each time 5 min. Under the conditions at 100 ℃ with 0.1 mol / L </p><p><b&g

54、t;　　結(jié)果</b></p><p><b>　　Vg基因的克隆</b></p><p>　　在進行1%瓊脂糖凝膠電泳進行RNA完整性的檢測后證明，卵巢的總RNA的完整性比較完整，如圖1，OD280/OD260=1.81,RNA的純度良好，可以用做于RT-PCR的模版。使用此RNA反轉(zhuǎn)錄</p><p>　　After using

55、1% agarose gel electrophoresis to test the RNA integrity ,the result proved that the integrity of the ovaries total RNA ‘s integrity relatively good., shown in Figure 1, OD280/OD260 = 1.81, RNA’s purity is good, can be u

56、sed as the RT-PCR template. Using this RNA reverse transcription</p><p>　　圖1 全RNA凝膠電泳圖</p><p>　　Fog.1　Electrophoretic result of total RNA</p><p>　　的cDNA第一條鏈為模版，以VgF1/VgR1為引物進行PCR反應

57、，電泳檢測如圖2所示，得到了5條帶，將預期大小500 bp附近的帶切膠回收?？寺〉紼.coli DH5α菌株,測序得到了長度為474 bp的核苷酸序列，序列如圖3所示。使用DNAMAN將高背長額蝦、羅氏沼蝦Vg mRNA序列與得到的序列進行比對，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示其與羅氏沼蝦、高背長額蝦Vg mRNA序列的同一性為64%和62%。同時將該序列在NCBI上的Blastn進行比對,發(fā)現(xiàn)該序列與Genbank登錄的刀額新對蝦、短溝對蝦的

58、部分Vg mRNA序列的同一性分別達到了66%和65%，由此可以推斷此序列為中華鋸齒米蝦部分Vg cDNA序列。</p><p>　　to get the cDNA first strand ,used it as a template and VgF1/VgR1 as primers to execute PCR reaction, detected of electrophoresis showed in F

59、igure 2, got five bands and cut the band of gel in the vicinity of the expected size of 500 bp. And cloned into E.coli DH5α strain ,sequenced and got the length of 474 bp nucleotide sequence, sequence shown in Figure 3.

60、Use DNAMAN to compare the high-back long prawns’Vg RNA sequence with Macrobrachium rosenbergii,the results shown in Figure 4. The results </p><p>　　M-marker；1-VgF1/VgR1所擴增片段</p><p>　　圖2成熟雌蝦卵巢總R

61、NA RT-PCR瓊脂糖電泳結(jié)果</p><p>　　Fog.2　Electrophoretic result of RT-PCR of the mature shrimp ovary total RNA</p><p>　　1 GTTGGCGGCT CAGAGATCCT GACCTTCGAT CTTTTTGTAC TGCGAACCCC TCTATCACCA</p>

62、<p>　　61 TGCAAGGTTC TTTTGGTCGC TTATAAATCC AACTCCCTCA TCATGGAACA CCCACACTCC</p><p>　　121 TCCCATAATC CACAGCTCAC TCTCAAGACA CAGGTGGGTA ATGTTGTCAT CAAACCTGAT</p><p>　　181 TTCAAAGTCA

63、TCGTTGATGG CAGCGAAATG AATGGTAACC ATGAAAATAA AGGAATGATG</p><p>　　241 CAGATATGGA AGAATGAAGA CAAAATCAAG ATTGCTACTC CATTCATGAT TCTAAGAGCG</p><p>　　301 TATCCAAAGA ATAATGTAAT CTCTGTTGAG ATGAATGG

64、TT GGACCTTTGG ACATGTGGCA</p><p>　　361 GGTCTTATGG GTACCTTTGA TGGTGAAAAG GCTAATGACT GGTATACACC TCAGGGAACC</p><p>　　421 AAAGCCCTCA ATATGCAAGA GCTTGTGAAG TCATGGCAGG AGGACCGACA GTG</p>&

65、lt;p>　　圖3 中華鋸齒米蝦卵黃蛋白原部分cDNA序列（474 bp）</p><p>　　Fig.3　Partial sequence of Vg cDNA of Neocaridina denticulata sinensis (474 bp)</p><p>　　Vg基因表達特征的研究</p><p>　　中華鋸齒米蝦不同發(fā)育時期的卵巢和肝胰腺的內(nèi)參

66、與目的條帶的RT-PCR結(jié)果如圖4，在不同發(fā)育時期，卵巢與肝胰腺均有224 bp產(chǎn)物，內(nèi)參均445 bp產(chǎn)物。有使用quantity one軟件對各個不同泳道的進行分析，得到目的片段與內(nèi)參條帶灰度的比值結(jié)果，結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明在不同卵細胞發(fā)育時期，卵巢與肝胰腺均表達Vg。在卵巢發(fā)育Ⅱ期到卵巢發(fā)育Ⅲ期，肝胰腺均為Vg主要合成部位，在卵巢發(fā)育Ⅱ期，肝胰腺中的Vg mRNA表達量就高于卵巢，到達卵巢發(fā)育Ⅲ期，肝胰腺中Vg的表達量上升達到

67、一個峰值，達到了卵巢中表達量的4倍，而卵巢中的表達量略微下降，而在卵巢發(fā)育Ⅴ期，肝胰腺的Vg表達量急劇下降，卵巢的Vg表達量上升達到一個最高值。此時，卵巢成為Vg的主要合成場所。</p><p>　　The RT-PCR results to the restricted reference materials strip bands and purpose bands of different developm

68、ental stages of the Neocaridina denticulata sinensis ovary and hepatopancreas shown in Figure 4, at different development stages,both ovaries and hepatopancreas have product 224bp, restricted reference materials are all

69、a product of 445 bp. Used quantity one software to analyze various lane obtained the gray ratio of the purpose fragment bands and restricted reference materials .The result</p><p>　　圖4 不同卵巢發(fā)育時期卵巢與肝胰腺RT-PCR產(chǎn)物

70、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果</p><p>　　M為marker，1,3,5分別為卵巢發(fā)育Ⅱ期，卵巢發(fā)育Ⅲ期與卵巢發(fā)育Ⅴ期的卵巢RNA PCR產(chǎn)物條帶，2，4，6分別為卵巢發(fā)育Ⅱ期，卵巢發(fā)育Ⅲ期與卵巢發(fā)育Ⅴ期肝胰腺RNA PCR產(chǎn)物條帶，7為肌肉對照</p><p>　　Fog.4　Electrophoretic result of different ovarian developmental

71、stages of ovarian and liver pancreastotal RNA RT-PCR</p><p>　　表2 不同卵巢發(fā)育時期卵巢與肝胰腺RT-PCR結(jié)果的灰度比值</p><p>　　Table 2 the gray-scale ratio of different ovarian developmental stages of ovarian and liver

72、pancreas RT-PCR results</p><p>　　Vn發(fā)生的免疫組化分析</p><p>　　鏡檢結(jié)果表明本實驗所選用的卵巢樣品中的卵子有的處于卵原細胞期，有的處于卵黃發(fā)生期，還有的處于即將成熟的時期，其中處于卵黃大量生成時期的卵子占據(jù)多數(shù)。實驗對每個樣品都做了三種不同處理，即甲苯胺藍染色、免疫組化試驗、對照組試驗（用PBS代替抗血清）。通過對同一樣品三種不同處理的實驗結(jié)

73、果進行觀察發(fā)現(xiàn)：實驗組的同一樣品中，卵原細胞較卵黃發(fā)生時相的卵子或即將成熟的卵子而言總是顯色較淺；卵母細胞核較細胞質(zhì)而言總是顯色較淺；卵黃發(fā)生中后期的卵母細胞質(zhì)顯色深淺總是不一致，那些圍繞細胞核成圈分布且離核較遠部位的卵黃球顯色較深，近核胞質(zhì)顯色較淺；即將成熟的卵母細胞質(zhì)顯色程度都比較一致；此外，濾泡細胞的免疫反應也呈陽性。對照組的免疫組化實驗都是用PBS代替抗血清進行孵育的，因此對照組的免疫反應都呈陰性(圖版Ⅴ和圖版Ⅵ)</p&

74、gt;<p>　　Microscopic examination’s results show that the experimental egg in the ovary samples, some in the stage of original egg-cell, and some in the vitellogenesis period, and some are about to mature period, w

75、hich generated a large number of egg yolk are the majority. Experiments are done on each sample of three different treatment, toluidine blue staining, immunohistochemistry test, the control group test (using PBS instead

76、of anti-serum). By the same sample of three different treatment observed exp</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　多年來，對于甲殼動物Vg合成部位，不同動物、不同學者做出的結(jié)論有著很大的不同。1984年,Yano和Chinzei[]發(fā)現(xiàn)日本囊對蝦Vg只在卵巢中合成，他

77、們認為卵巢是其Vg唯一的合成場所。Browdyd等[]對短溝對蝦的研究結(jié)果也認為卵巢是唯一的Vg的合成部位, Fainzilber等[]的結(jié)果也表明短溝對蝦Vg合成部位主要還是為卵巢,但是在2000年，Atsuro Okuno[]利用real-time RT-PCR的方法確定羅氏沼蝦肝胰腺是Vg最主要的合成場所。Quackenbush[]用體外組織培養(yǎng)和免疫化學的方法證明凡納濱對蝦Vg來自于與卵巢和肝胰腺,同時認為肝胰腺合成的Vg通過血

78、淋巴輸送到卵巢。</p><p>　　For many years,Vg synthetic site of crustaceans, different animals 、different scholars have a very different conclusion. In 1984, Yano and Chinzei found that Japanese Marsupenaeus Vg synthe

79、sis only in the ovary, they believe ovarian is the only Vg synthesis place. Browdyd etc.’s findings about P.semisulcatus also believe that ovarian is the only site of the Vg synthesis, Fainzilber etc.’s</p><p&

80、gt;　　results are also showed that Penaeus semisulcatus Vg synthetic site mainly for the ovary, but in 2000, Atsuro Okuno used real-time RT-PCR method to determine rosenbergii’s hepatopancreas is the most important synthe

81、sis place of Vg. Quackenbush use the method of vitro tissue culture and immuno-chemical to demonstrate Litopenaeus vannamei Vg from both ovarian and hepatopancreas, at the same time,they believes that the Vg aynthesizyed

82、 by hepatopancreas transport through the hemolymph to the ovaries</p><p>　　半定量PCR結(jié)果顯示中華鋸齒米蝦的Vg mRNA在卵巢和肝胰腺均有表達,Vg基因的表達結(jié)果表明在卵巢發(fā)育早期Vg的表達以肝胰腺為主，而后期以卵巢為主。在卵細胞發(fā)育后期，卵巢Vg表達量上升而肝胰腺Vg表達量急劇下降，這與2006年張成鋒等[]對中國對蝦不同卵巢發(fā)育階

83、段的卵巢與肝胰腺中Vg表達的研究結(jié)果基本相同。由此可以推斷，Vg主要在肝胰腺進行合成，而卵巢可能是一個對Vg進行修飾加工的主要場所。而在卵細胞的發(fā)育早期與中期，肝胰腺是Vg的一個主要的合成場所。</p><p>　　Semi-quantitative PCR results showed that Neocaridina denticulata sinensis’s Vg mRNA were expressed

84、both in the ovary and hepatopancreas, Vg gene expression results show that ovarian is the main site of the Vg expression in the early development, In the later period dominated by ovaries. In the latter development of oo

85、cyte, ovarian Vg expression increases but the expression of hepatopancreas Vg sharp decline, the findings is basically the same to the studies by Zhang Feng et al on Neocaridina de</p><p>　　而Vn免疫組化后電鏡觀察得出了以下

86、結(jié)論：中華鋸齒米蝦卵巢中Vn合成途徑是內(nèi)源性的，主要場所是卵母細胞質(zhì)。在卵黃發(fā)生前，卵母細胞中的卵黃物質(zhì)較少。到了卵黃發(fā)生時期，卵母細胞中的卵黃物質(zhì)快速積累增多，卵母細胞體積也隨之不斷增大，細胞形狀開始變得不規(guī)則，細胞核逐漸解體，成熟期時甚至完全消失。由髓樣溶酶體形成的卵黃球在卵母細胞中的分布較有特點，它總是圍繞細胞核成圈地分布在離核較遠的部位，其結(jié)果與中國明對蝦相同[]。在1994年，李懷梅[]的中國明對蝦卵巢的電鏡觀察結(jié)果和本文的實

87、驗結(jié)果均支持Vg的起源二元論，均認為途徑一是卵母細胞的核排出物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等均參與卵黃的合成;途徑二是卵母細胞通過胞飲作用吸收肝胰腺通過血淋巴所輸出過來的物質(zhì)參與卵黃形成。</p><p>　　綜上所述，中華鋸齒米蝦Vg內(nèi)源發(fā)生場所是卵巢中的卵母細胞，而外源發(fā)生場所主要是肝胰腺。</p><p>　　The electron microscopy after immunohistoch

88、emical staining Vn got the following conclusions: Neocaridina denticulata sinensis ‘s Vn synthesis in ovary is endogenous, the main place is the oocyte cytoplasm. Before yelk occur in the oocytes,the yolk material is les

89、s. To the vitellogenesis period, yolk material is in the rapid accumulation ,oocyte volume is also increasing, cell shape became irregular, the gradual disintegration of the nucleus, or even completely disappear during m