（節(jié)選）2014年--遺傳學(xué)外文翻譯--一種對大量病人的循環(huán)腫瘤dna超靈敏定量檢測方法（譯文）

1、<p><b>　　中文5250字</b></p><p>　　出處：Newman A M, Bratman S V, To J, et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J]. Nature Medicine, 2014,2

2、0(5):548-554.</p><p>　　一種對大量病人的循環(huán)腫瘤DNA超靈敏定量檢測方法</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是一種在非侵入性腫瘤負(fù)擔(dān)評(píng)估中極具前景的分子標(biāo)記，然而現(xiàn)如今的ctDNA檢測技術(shù)在敏感度或病人覆蓋率以及臨床應(yīng)用前景中存在不足。在此我們推出一種經(jīng)濟(jì)而高敏感度

3、的定量ctDNA的技術(shù)——CAPP-Seq（腫瘤個(gè)性化深度測序檔案）。我們在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中實(shí)施了涵蓋95%腫瘤中確定突變的體細(xì)胞改變的多類別CAPP-Seq。我們發(fā)現(xiàn)在100%的II-IV期以及50%的Ⅰ期NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)ctDNA，并且96%的等位基因突變存在特異性低至0.02%的片段。ctDNA的水平與腫瘤體積，微小殘留病灶以及治療相關(guān)影像學(xué)改變之間存在高度相關(guān)性，因此ctDNA水平的測量比影像學(xué)能讓我們更早的

4、做出評(píng)估與對策。最后，我們通過CAPP-seq評(píng)估免活檢腫瘤篩查和基因分型。我們設(shè)想，應(yīng)用CAPP-sep以檢測和監(jiān)測不同的惡性腫瘤可以作為常規(guī)臨床檢測，從而促進(jìn)個(gè)性化癌癥治療</p><p>　　對ctDNA的分析有顛覆當(dāng)前對腫瘤的發(fā)現(xiàn)與監(jiān)測的可能性。這種非侵入性獲取腫瘤來源DNA的方法在那些無法通過非侵入性手段對此取樣的實(shí)體腫瘤中非常受歡迎。在非小細(xì)胞肺癌中，已有基于PCR技術(shù)的序列以用于發(fā)現(xiàn)血漿DNA基因中

5、的復(fù)發(fā)變異點(diǎn)例如KRAS（鼠類肉瘤病毒癌基因）或EGFR（表皮生長因子受體），然而大部分病人并沒有在這些位點(diǎn)的變異情況。近來也有使用大規(guī)模平行測序來探測ctDNA的技術(shù)。然而這些報(bào)道的數(shù)據(jù)都體現(xiàn)了這些測序方法在敏感性上的不足，僅適用于一個(gè)較小的病人群體，對病人都需要額外的最佳算法以及額外的開銷。為了克服以上不足，我們設(shè)計(jì)了一種新的統(tǒng)計(jì)分析ctDNA的策略。我們的策略，CAPP-Seq，將優(yōu)化大眾低水平DNA基因庫與多相生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合

6、，設(shè)計(jì)了一個(gè)由生物素化的DNA寡核苷酸構(gòu)成的， 針對我們關(guān)注的腫瘤的循環(huán)變異區(qū)域的“篩選器”。為了監(jiān)測ctDNA，選擇器用于腫瘤基因鑒定，以確定病人的腫瘤特異性基因偏差，然后直接在ctDNA中進(jìn)行定量。在這里，我們展示其技術(shù)性能并探索CAPP-seq在早期和晚期NSCLC患者的效用。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　為NSCLC所設(shè)計(jì)的C

7、APP-Seq篩選器</p><p>　　在CAPP-seq實(shí)施初期，盡管我們的方法是適用于任何存在已被確定的復(fù)發(fā)突變的癌癥，我們著重關(guān)注NSCLC。為了設(shè)計(jì)一個(gè)非小細(xì)胞肺癌的篩選器，我們開始從COSMIC數(shù)據(jù)庫以及其他資源中列入那些可能驅(qū)動(dòng)復(fù)發(fā)突變的基因的外顯子。之后，利用TCGA中所收錄的407位NSCLC患者的全基因組測序數(shù)據(jù)，我們應(yīng)用一種迭代算法以最大化每個(gè)病人的錯(cuò)義突變數(shù)量而同時(shí)最小化篩選器的大小<

8、;/p><p>　　大約8%的NSCLC受體變異涉及受體酪氨酸激酶基因編碼ALK（間變性淋巴瘤受體酪氨酸激酶基因），ROS1基因（酪氨酸激酶1）或RET原癌基因17-21。為了利用在內(nèi)外顯子固有的連接變異中特有的序列的低錯(cuò)義率，我們涉及了內(nèi)含子和外顯子基因生成中的這些的反復(fù)融合斷點(diǎn)以完成最后設(shè)計(jì)。為了檢測腫瘤組織和血漿DNA中的基因融合。我們開發(fā)了一個(gè)為了優(yōu)化的超深覆蓋率數(shù)據(jù)的斷點(diǎn)測序算法，該算法的所應(yīng)用的下一代測序

9、法（NGS）通過兩個(gè)非小細(xì)胞肺癌的數(shù)據(jù)從核苷酸層面將已知的細(xì)胞受體基因融合與以前所識(shí)別到的未知斷點(diǎn)。</p><p>　　總的來說，非小細(xì)胞肺癌的篩選器的設(shè)計(jì)覆蓋521個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子139復(fù)發(fā)性突變基因，總覆蓋約125 KB。這個(gè)小目標(biāo)區(qū)間中（人類基因組的0.004%），篩選器能得到單核苷酸變異（SNV）的中位數(shù)為四，并覆蓋96%例肺腺癌或鱗狀細(xì)胞癌。為了驗(yàn)證每個(gè)腫瘤的基因突變的數(shù)目，我們研究了從一個(gè)獨(dú)立

10、的隊(duì)列183例肺腺癌的WES數(shù)據(jù)的選擇區(qū)域。我們的篩選器覆蓋了以4個(gè)SNV為中位數(shù)的88%的病例，比從隨機(jī)抽樣的外顯子組所預(yù)期的要多4倍，從而驗(yàn)證我們篩選器所設(shè)計(jì)的算法。</p><p><b>　　方法優(yōu)化與績效評(píng)價(jià)</b></p><p>　　我們通過NSCLC選擇器進(jìn)行深度測序并實(shí)現(xiàn)約 10000×覆蓋（去除兩分法）基于測序深度中位數(shù)以及ctDNA檢測

11、限的考慮。我們共應(yīng)用90個(gè)樣本，包括兩組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，17份原發(fā)腫瘤樣本與其對應(yīng)外周血白細(xì)胞（PBL）以及18人的40血漿樣品，其中包括5為健康13位NSCLC患者。為了評(píng)估和優(yōu)化篩選性能，我們首先將它應(yīng)用于從健康對照血漿中純化ctDNA，觀察其有效的捕獲到一致的基因組的DNA。血漿DNA片段測序得平均長度約170 bp ，與包含在染色體DNA的長度對應(yīng)。通過優(yōu)化小批量的血漿DNA，我們將回收效率提高了300% 并構(gòu)建了低至4納克

12、DNA的偏倚數(shù)據(jù)庫。</p><p>　　影響CAPP-Seq的檢測限和精度的因素有(i)循環(huán)DNA分子的回收率和輸入數(shù)量(ii)樣品交叉污染(iii)捕獲試劑和等位基因存在的潛在偏差(iv) PCR或測序錯(cuò)誤。我們依次檢查了這些因素的每一個(gè)。首先，通過比較每一個(gè)樣本的輸入分子量與庫的復(fù)雜性的估計(jì)，我們計(jì)算出循ctDNA分子≥回收率49%。這與PCR產(chǎn)量之后計(jì)算出分子量一致。其次，通過分析病人的特定基因單核苷酸多

13、態(tài)性（SNP）的樣本，我們發(fā)現(xiàn)0.06%的多倍血漿DNA存在交叉污染，促使我們可以通過進(jìn)一步分析可以將另一個(gè)病人檔案中的SNP種系從腫瘤衍生的SNV排除。接下來，我們評(píng)估病人外周血白細(xì)胞（PBL）樣本中雜合SNP種系中的等位基因偏移，并觀察捕捉到參考等位基因變異的最小偏倚。最后，我們分析了40種血漿DNA樣本在非參考等位基因中的分布，包括腫瘤衍生的SNVs和SNP種系。我們發(fā)現(xiàn)，0.006%的平均值和0.0003%中位數(shù)的背景，分別為（

14、圖2D），均大大低于先前報(bào)道的NGS 中分析ctDNA方法。</p><p>　　非種系ctDNA也可能在沒有腫瘤的情況下出現(xiàn)，這歸因于不同組織癌前細(xì)胞的貢獻(xiàn)，諸如此類的”生物背景“也有可能影響CAPP-Seq的敏感性。我們推測，生物背景，如果存在的話，會(huì)升高頻發(fā)突變位置已知的癌癥驅(qū)動(dòng)基因的突變率，因此在所有40個(gè)樣品中25個(gè)發(fā)現(xiàn)107個(gè)癌癥相關(guān)的SNV，且不包括在每個(gè)病人的腫瘤發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞突變。雖然中位數(shù)的分?jǐn)?shù)

15、豐富與全球選擇背景是可比較的（約0%），平均值略高，約0.01%。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)突變熱點(diǎn)（抑癌TP53，r175h）在血漿中的DNA樣本的頻率約為0.18%，包括患者和健康對照組。當(dāng)我們觀察這TP53突變等位基因的頻率要明顯高于全球背景（P＜0.01），我們推測，它反映了真實(shí)的生物克隆異質(zhì)性，從而排除了它作為一個(gè)潛在的報(bào)道位點(diǎn)的可能。為了更一般地處理背景，我們將背景率等位基因特異性差異標(biāo)準(zhǔn)化，以評(píng)估ctDNA檢測的意義。結(jié)

16、果是，我們發(fā)現(xiàn)，生物背景的檢測限略高于0.01% ，不是影響ctDNA定量的主要因素。</p><p>　　接下來，我們嘗試性檢測CAPP-Seq的檢測限以及線性。我們準(zhǔn)確地檢測輸入的高線性度的分?jǐn)?shù)豐度在0.025%和10%之間的的非小細(xì)胞肺癌DNA，我們觀察到在四個(gè)SNP報(bào)道的臨界值僅有邊緣的誤差度量改善，這相當(dāng)于每個(gè)腫瘤的選擇器確定SNV的中位數(shù)。此外，融合斷點(diǎn)的豐度分?jǐn)?shù)，插入和缺失（indel）和拷貝數(shù)變化

17、（CNAS）與預(yù)期濃度高度相關(guān)。</p><p>　　體細(xì)胞突變檢測與腫瘤負(fù)荷定量</p><p>　　我們接下來將CAPP-seq應(yīng)用于在17例NSCLC腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞突變，樣本包括福爾馬林固定的手術(shù)切除，穿刺活檢標(biāo)本及惡性胸腔積液。在腫瘤和其對應(yīng)的樣品系中實(shí)施大約5000×平均測序深度（去除兩分法），我們發(fā)現(xiàn)了100%個(gè)先前確定的SNVs和基因融合和發(fā)現(xiàn)了許多額外的體細(xì)

18、胞變異。此外，我們在堿基層次中發(fā)現(xiàn)了特定斷點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)這八個(gè)特定基因融合的伴侶基因涉及ALK和ROS1。腫瘤所含變異幾乎預(yù)計(jì)一樣，從不吸煙者含有的SNV比那些人的基因融合較少。</p><p>　　排除患者基因融合，我們發(fā)現(xiàn)每名患者有平均六個(gè)SNVs（三錯(cuò)義）（表1），與我們的篩選器設(shè)計(jì)一致。</p><p>　　我們評(píng)估了SAPP-seq疾病監(jiān)測和微小殘留病的檢測中的敏感性和特異性，我們使用

19、從5名健康對照者以及13位非小細(xì)胞肺癌患者所收集的35例血漿樣本。我們綜合在多個(gè)實(shí)例和體細(xì)胞突變的信息作為ctDNA的檢測指標(biāo)。該指數(shù)是類似于一個(gè)和基于以突變斷點(diǎn)為優(yōu)先的決策樹的假陽性率，由于其所存在的背景的P值從多個(gè)類型報(bào)道集成。當(dāng)我們將這種方法應(yīng)用在接受器操作特征（ROC）分析，CAPP-seq曲線下的面積（AUC，濃度-時(shí)間曲線下面積）為0.95，對于所有血漿DNA標(biāo)本具有最大的靈敏度和特異性，未經(jīng)治療的患者85%，健康對照組為9

20、6%。Ⅰ期腫瘤患者的敏感性為50%，其中Ⅱ-IV期腫瘤的敏感性為100%，兩組的特異性為96%。此外，CAPP-Seq表現(xiàn)出強(qiáng)大的同時(shí)分析前、后樣品性能，AUC值在所有階段為0.89，在II–IV階段0.91。此外，通過調(diào)節(jié)ctDNA檢測指標(biāo)，我們可以增加特異性高達(dá)98%同時(shí)還捕捉三分之二的所有癌癥陽性樣本及四分之三的II期–IV期癌陽性標(biāo)本。因此，CAPP-seq可以實(shí)現(xiàn)腫瘤負(fù)擔(dān)強(qiáng)大的評(píng)估以及根據(jù)樣本可變的的敏感性和特異性。</

21、p><p>　　血漿樣品中NSCLC腫瘤負(fù)荷定量</p><p>　　我們不禁發(fā)問，是否與放射學(xué)測量腫瘤體積和臨床治療療效與可檢測到的ctDNA水平相關(guān)。</p><p>　　根據(jù)SNV或報(bào)道，血漿中的碎片ctDNA水平從0.02% 到 3.2%不等，在未治療樣本中中位數(shù)約為0.1%。在未治療樣本中絕對的ctDNA水平顯著的與計(jì)算機(jī)斷層掃描檢測（CT）以及正電子成像術(shù)（

22、PET）中的腫瘤體積相關(guān)。</p><p>　　要確定是否ctDNA濃度縱向反映樣本的疾病負(fù)擔(dān)，我們分析了三例不同的治療方案晚期非小細(xì)胞肺癌患者的血漿DNA。在未治療樣品中，在治療過程中ctDNA水平和腫瘤體積高度相關(guān)，無論所檢測到的變異類型是一系列SNV，得失位變異，多基因融合或基因融合與SNV并存。</p><p>　　值得注意的是，在一個(gè)病人中，我們確定了一個(gè)經(jīng)典的EML4-ALK基

23、因融合，以及先前未涉及的兩個(gè)ROS1基因融合：fyn-ros1和ros1-mkx。所有的融合由基因組DNA擴(kuò)增定量PCR（qPCR）證實(shí)并在血漿樣品中分別重建。據(jù)我們所知，這是第一次在同一非小細(xì)胞肺癌患者觀察ROS1和ALK的基因融合。我們設(shè)計(jì)的非小細(xì)胞肺癌的CAPP-seq選擇器在每個(gè)腫瘤中檢測多個(gè)SNV。</p><p>　　在另一個(gè)病人中，這樣的篩選器使我們能夠識(shí)別與活化的EGFR突變的優(yōu)勢克隆以及一個(gè)導(dǎo)致

24、厄洛替尼耐藥的“門衛(wèi)”EGFR T790M克隆突變。血漿DNA中這些克隆的比率與腫瘤活檢中的完全一致，這表明我們的方法有用于檢測和量化潛在的臨床相關(guān)的亞克隆的潛力。</p><p>　　II、III期非小細(xì)胞肺癌患者常有放療及監(jiān)控CT或PET-CT掃描的輻射在肺和周圍組織引起炎癥和纖維化改變因而難以到達(dá)病灶。一個(gè)IIB期非小細(xì)胞肺癌的患者在經(jīng)過放射治療后，隨訪成像顯示存在一個(gè)代表疾病殘留的大腫塊。然而，與此同時(shí)檢

25、測不到ctDNA（表示無疾病殘留），患者無病生存22個(gè)月后，說明ctDNA的結(jié)果為真。另一個(gè)病人是IIIB期非小細(xì)胞肺癌，接受放化療治療，隨訪成像顯示接近完全治愈，然而，的ctDNA濃度略有增加，表示存在隱匿性微小病變進(jìn)展，事實(shí)上，7個(gè)月后進(jìn)展到臨床檢測程度，病人最終死于肺癌。這些數(shù)據(jù)說明ctDNA在鑒別患者在經(jīng)過治療后是否存在復(fù)發(fā)病灶非常有效。</p><p>　　我們試問低CAPP-seq檢測限是否能允許我們

26、更早的檢測到更早期的NSCLC呢？這里舉兩位病人為例子。一位接受了手術(shù)，立體定向放療（SABR）27的患者，確診是IB期NSCLC。我們在其治療前血漿樣品中檢測到ctDNA，然而在術(shù)后的3-32個(gè)月并未檢測到ctDNA，這表明該病人并未患病或已治愈。另一位初始PET-CT監(jiān)測掃描以及之后的SABR顯示腫瘤存在剩余量，該影像學(xué)結(jié)果解釋為代表殘余腫瘤或放療后炎癥。我們通過檢測ctDNA沒有發(fā)現(xiàn)任何疾病殘留的證據(jù)，而病人在治療后21個(gè)月隨訪內(nèi)

27、仍然無病，這與之后病人無病的假說相符。總之，這些結(jié)果表明CAPP-seq存在測量早期和晚期非小細(xì)胞肺癌，在不同類型的治療ctDNA監(jiān)測腫瘤的負(fù)擔(dān)的潛能。</p><p>　　無組織活檢和腫瘤基因分型</p><p>　　最后，我們探討了CAPP-seq是否有DNA序列系統(tǒng)分析并用于癌癥篩查和活檢游離腫瘤基因分型的潛能。作為基本證明，我們使自己不知道每個(gè)病人的腫瘤的基因突變，并應(yīng)用了一個(gè)新的

28、統(tǒng)計(jì)方法，以測試在每個(gè)血漿樣品在我們的隊(duì)列中存在的癌癥基因。通過實(shí)施我們的高特異性癌癥篩查方法，我們正確地通過豐度分?jǐn)?shù)為0.4%的ctDNA成功將100%的病人血漿樣本分類，假陽性率為0%。因此CAPP-Seq有提高對高危進(jìn)展NSCLC患者中，低劑量CT篩查的低陽性預(yù)測值。</p><p>　　此外，當(dāng)我們考察CAPP-seq無創(chuàng)性檢測EGFR和KRAS突變的能力時(shí)，我們100%正確得檢測到了特異性大于99%的，

29、等位分?jǐn)?shù)大于0.1%的變異。CAPP-seq可能因此使免活檢游離腫瘤活檢基因型患者的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌的效用最大化。然而，檢測與確定Ⅰ期腫瘤基因型的技術(shù)方面，還要方法上的改進(jìn)。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　在這項(xiàng)研究中，我們提出了為ctDNA定量新方法，CAPP-seq。其主要特點(diǎn)包括高靈敏度和特異性，卻沒有對所有非小細(xì)胞肺

30、癌患者具體優(yōu)化和覆蓋范圍的需要。據(jù)我們所知，CAPP-seq是第一個(gè)以NGS為基礎(chǔ)的分析ctDNA的方法，在一個(gè)合理的成本內(nèi)達(dá)到超低檢測限和廣大患者的覆蓋范圍。我們的方法，通過整合多個(gè)病例以及多系列突變的信息內(nèi)容，降低了潛在的隨機(jī)背景和生物變異對腫瘤負(fù)擔(dān)定量的影響（例如，突變或檢測限附近的亞進(jìn)化）。這些特點(diǎn)使微小殘留病和I期非小細(xì)胞肺癌腫瘤DNA定量檢測更加便利。雖然我們專注于非小細(xì)胞肺癌，我們的方法可以對于任何惡性腫瘤的復(fù)發(fā)突變數(shù)據(jù)都

31、是可用的。</p><p>　　在許多患者中，DNA水平大大低于先前描述的基于測序的結(jié)論的檢測閾值。例如，在大多數(shù)肺癌和結(jié)直腸癌中治療前ctDNA濃度＜0.5%，治療后，ctDNA的濃度通常下降，因而需要更低的檢測閾值。此前公布的ctDNA檢測方法采用擴(kuò)增子，全外顯子，或全基因組測序，即使在十倍或更大的測序成本下，在檢測多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者ctDNA中不夠敏感。</p><p>　　為了進(jìn)

32、一步擴(kuò)大ctDNA定量在臨床應(yīng)用的潛力，在檢測閾值的額外收益是可取的。潛在的方法包括使用DNA條形碼技術(shù)以抑制PCR文庫制備中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，增加用于ctDNA分析的量以超過在我們的研究中使用的平均血漿量1.5毫升等策略。</p><p>　　CAPP-Seq 的第二限制是其捕獲基因融合上的不足，這有可能低估腫瘤負(fù)擔(dān)。然而，當(dāng)這些偏倚類型在其他報(bào)道中出現(xiàn)過之后是可以分析解決的。最后，盡管我們發(fā)現(xiàn)CAPP-seq可以定

33、量CNAs（血漿循環(huán)核苷酸），我們當(dāng)前篩選器的設(shè)計(jì)沒有優(yōu)先考慮這些類型的誤差，我們預(yù)計(jì)，加入一定的對CNAS的覆蓋將被證明在監(jiān)測不同類型的癌癥中是有用的。綜上所述，對血漿DNA的雜交捕獲和高通量測序使大部分NSCLC患者的ctDNA非侵入性高敏感檢測成本降低。CAPP-Seq因此有應(yīng)用于常規(guī)臨床，促進(jìn)個(gè)性化檢測，治療以及監(jiān)控的潛力。我們預(yù)計(jì)，CAPP-seq將在各種臨床環(huán)境被證明是有價(jià)值的，包括在生物流體和標(biāo)本與低癌癥細(xì)胞樣本的癌細(xì)胞D