甜菜M14品系BvM14-glyoxalaseⅠ基因的克隆與功能分析.pdf

1、甜菜M14品系是在栽培甜菜（BetavulgarisL.）染色體組上附加野生白花甜菜（B．corollifloraZoss.）第9號染色體的甜菜單體附加系。經(jīng)鑒定甜菜M14品系具有野生白花甜菜的一些優(yōu)良性狀，如抗旱性、耐鹽性、抗寒性以及無融合生殖等，課題組推測甜菜M14品系展現(xiàn)的優(yōu)良性狀可能與白花甜菜第9號染色體的導入有關，因此甜菜M14品系是挖掘和利用甜菜優(yōu)質(zhì)基因，促進栽培甜菜育種改良的良好材料。
　　 前期工作基礎中，課題組

2、以栽培甜菜為對照，對甜菜M14品系花器官進行了比較蛋白質(zhì)組學研究，共獲得差異蛋白質(zhì)點71個，乙二醛酶Ⅰ是其中之一。甜菜M14品系鹽脅迫下的比較蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，乙二醛酶Ⅰ蛋白在葉片中受鹽脅迫上調(diào)表達（2倍），說明乙二醛酶Ⅰ可能參與甜菜M14品系的抗鹽過程。本試驗是對甜菜M14品系乙二醛酶Ⅰ基因功能的深入研究。
　　 乙二醛酶Ⅰ與能量代謝密切相關，廣泛存在于動物、植物和微生物中。在輔因子還原型谷胱甘肽(GSH)的協(xié)助下，乙二醛酶

3、Ⅰ將丙酮醛(methylglyoxal，MG)轉(zhuǎn)化為S-D-乳酰谷胱甘肽，乙二醛酶Ⅱ以其為底物，最終轉(zhuǎn)化為D-乳糖，從而降低MG含量，解除MG對細胞的毒害損傷。除此之外，乙二醛酶Ⅰ還參與調(diào)控細胞的分裂和增殖、微管組裝、囊泡的活化等過程，與細胞的有絲分裂過程密切相關。近年來，研究發(fā)現(xiàn)乙二醛酶Ⅰ廣泛參與植物非生物脅迫的應答反應，同時還對病菌侵染植物組織產(chǎn)生應答現(xiàn)象，說明植物乙二醛酶Ⅰ在作物改良及植物抗逆機制研究中具有潛在的應用價值。

4、　　 本試驗基于課題組的前期工作基礎，利用電子克隆及RACE技術獲得甜菜M14品系乙二醛酶Ⅰ基因(BvM14-glyoxalaseⅠ)cDNA全長，共計1449bp，包含1065bp的最大ORF，編碼354aa;序列分析顯示，該蛋白質(zhì)含有兩個乙二醛酶結構域及多個谷胱甘肽、金屬離子結合位點：半定量RT-PCR分析結果顯示BvM14-glyoxalaseⅠ基因在甜菜M14品系根、莖、葉、花中廣泛表達，且在花中表達量最高；該基因能夠應答高鹽

5、、干旱、氧化脅迫，并在根和葉中參與不同的應答機制。
　　 構建了BvM14-glyoxalaseⅠ基因的大腸桿菌表達體系，在0.5mmol/LIPTG、37℃的誘導條件下BvM14-glyoxalaseⅠ蛋白表達量最大，并主要以包涵體的形式存在；Western印跡結果呈陽性，說明BvM14-glyoxalaseⅠ融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中能夠正確表達。以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒菌株為對照，對轉(zhuǎn)BvM14-glyoxalaseⅠ基因的

6、大腸桿菌BL21(DE3)菌體在MG脅迫下的生長曲線進行了測定，結果顯示轉(zhuǎn)基因菌株比對照菌株提前1h進入生長期，說明BvM14-glyoxalaseⅠ基因能夠緩解MG對大腸桿菌生長的抑制。
　　 構建BvM14-glyoxalaseⅠ基因植物表達載體，并在煙草中穩(wěn)定表達。通過基因組PCR及RT-PCR篩選陽性植株；酶活測定結果顯示，T0代轉(zhuǎn)基因植株G2和G3葉片中glyoxalaseⅠ酶活力分別是對照野生型煙草WT的2.2倍和1

7、.5倍，說明BvM14-glyoxalaseⅠ基因在轉(zhuǎn)基因煙草中成功表達。葉盤抗性試驗結果顯示，在不同濃度的MG、NaC1、甘露醇及H2O2脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草G2葉片的褪綠速度遠遠低于WT葉盤。以WT幼苗為對照，對T1代轉(zhuǎn)基因煙草幼苗line2進行上述脅迫處理，結果顯示line2幼苗生長狀況、鮮重、根長、葉片褪綠情況均好于WT幼苗。以上結果證實甜菜M14品系BvM14-glyoxalaseⅠ基因的過量表達能夠提高煙草對MG、高鹽、干旱及氧