黃瓜單性花控制M-m基因的克隆與功能分析.pdf

1、性別表達(dá)是植物的基本發(fā)育過程，決定其育種和栽培方式，控制性別表達(dá)具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。黃瓜（Cucumis sativus L．）性型生理學(xué)和遺傳學(xué)研究豐富，是研究植物花性型分化的模式植物。除環(huán)境因子和植物激素影響外，黃瓜性型表達(dá)受三對(duì)主效基因（F/f, M/m和A/a）控制。雖然性型分化多樣，但單基因位點(diǎn)(M/m)控制單性花發(fā)育卻為黃瓜植物所特有。近年來，影響黃瓜雌性表型的F/f基因已被克隆，并被證明編碼1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶（A

2、CS）同源物。本研究從尋找與M/m基因連鎖的分子標(biāo)記入手，利用圖位克隆技術(shù)獲得M/m基因的候選基因，并對(duì)其編碼產(chǎn)物的生物化學(xué)功能以及相關(guān)調(diào)控方式進(jìn)行研究。
　　 首先利用分離集群分組分析法（BSA）結(jié)合序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)(SRAP)，鑒定到8個(gè)與M/m基因連鎖的分子標(biāo)記。用F2分離群體的167個(gè)單株檢測后發(fā)現(xiàn)，其中共顯性標(biāo)記MElEM26和顯性標(biāo)記ME1EM23分別位于M/m基因兩側(cè)，而共顯性標(biāo)記ME8SA7與M/m基因

3、共分離。利用黃瓜基因組BAC文庫介導(dǎo)的染色體步移技術(shù)，成功的將顯性標(biāo)記MElEM23轉(zhuǎn)化為共顯性的SCAR標(biāo)記S ME1EM23。結(jié)合另外兩個(gè)由標(biāo)記ME1EM26和標(biāo)記ME8SA7轉(zhuǎn)化的共顯性SCAR標(biāo)記S_ME1EM26和SME8SA7，在一個(gè)較大的900株分離群體中檢測后發(fā)現(xiàn)，M/m基因定位于標(biāo)記S ME1EM26和標(biāo)記S_ME1EM23之間，連鎖距離分別為5.4cM和0.7cM，標(biāo)記S_ME8SA7仍然與M/m基因共分離。

4、　　 利用最終2700株分離群體分析上述標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記S_ME8SA7與M/m基因之間存在2個(gè)交換單株。利用該標(biāo)記掃描基因組BAC文庫，獲得一個(gè)含有該區(qū)段的BAC克隆B87。經(jīng)末端測序，從B87的M13末端開發(fā)出一個(gè)SNP標(biāo)記并發(fā)現(xiàn)其與M/m基因存在3個(gè)交換單株。利用B87的T7末端序列掃描基因組BAC文庫獲得克隆B70。經(jīng)全片段鳥槍測序，開發(fā)出一個(gè)標(biāo)記SSR70并發(fā)現(xiàn)其與M/m基因存在1個(gè)交換單株。利用B70的T7末端獲得第三個(gè)BA

5、C克隆B85，經(jīng)全片段測序開發(fā)出另一個(gè)標(biāo)記SSR8504。經(jīng)分離群體分析表明，其與M/m基因存在2個(gè)交換單株，并與標(biāo)記SSR70位于M/m基因兩側(cè)。
　　 經(jīng)序列拼接，利用上述三個(gè)交換單株，鑒定到一個(gè)52kb的候選區(qū)間包含M/m基因。序列分析表明該區(qū)間存在兩個(gè)候選基因。通過共分離分析，不同性型黃瓜親本間多態(tài)性檢測，以及近等基因系間基因表達(dá)差異性分析，確定M/m基因的候選基因?yàn)镃sACS2，其編碼1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶(AC