畢業(yè)設(shè)計(jì)--二步發(fā)酵法年產(chǎn)30000噸古龍酸的初步工藝設(shè)計(jì)

1、<p><b>　　1前言</b></p><p>　　維生素c（vitaminC，以下簡稱Vc）又名L- 抗壞血酸（L- ascorbicacid），是一種人體必需的水溶性維生素。Vc廣泛存在于生物組織中，在新鮮水果、蔬菜和動(dòng)物肝臟等中的含量尤為豐富。綠色植物能夠自己合成Vc，而人和許多動(dòng)物由于肝臟中缺少一種古洛內(nèi)酯氧化酶，因而不能自己合成，必須從外界攝取。</p>

2、<p>　　1.1 維生素C的理化性質(zhì)</p><p>　　1.1.1 維生素C的結(jié)構(gòu)</p><p>　　維生素C（Vitamin C），簡稱VC,又名抗壞血酸(Ascobicacid)；分子式：C6H8O6，分子量176，結(jié)構(gòu)式見圖1。</p><p>　　圖1 維生素c結(jié)構(gòu)式</p><p>　　1.1.2 維生素c的物

3、理性質(zhì)</p><p>　　維生素c純品為白色單斜晶系的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭味酸，久置色漸微黃。易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿。它是一種不飽和的多羥基六碳化合物，以內(nèi)酯形式存在，在2，3位碳原子之間烯醇式羥基上的氫可游離出來，故具有酸性。維生素C具有很強(qiáng)的還原性，故極不穩(wěn)定，容易為熱或氧化劑所氧化，在中性或堿性溶液中尤甚；光、微量重金屬(特別是F2+、Cu2+)或熒光物質(zhì)(如核黃素)更能促進(jìn)其被氧化。微

4、量金屬元素對維生素C的氧化分解的催化作用，以銅離子為甚，其順序?yàn)镃u2+>Co2+>Mn2+>Zn2+>Fe2+。在低于pH5．5的溶液中，維生素C較為穩(wěn)定；所以提取維生素C時(shí)，草酸和偏磷酸是較好的穩(wěn)定劑。</p><p>　　1.2 維生素c的來源</p><p>　　維生素C 是簡單結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物,與單糖有密切關(guān)系。研究表明植物中含有抗壞血酸氧化酶，能催化維生

5、素C 氧化[1]，維生素C 廣泛分布在植物組織中,新鮮水果及蔬菜中含量尤多。多數(shù)哺乳類和禽類也都能由葡萄糖合成足夠數(shù)量的 L-抗壞血酸。但人、豚鼠、猴子、蝙蝠、某些爬行動(dòng)物及大多數(shù)人工養(yǎng)殖的魚類甲殼類體內(nèi)缺乏古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶, 不能將古洛糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成L-抗壞血酸，不能生物合成維生素C, 動(dòng)物體內(nèi)貯藏維生素C 量不大，它們必須經(jīng)常從環(huán)境或食物中攝取維生素C 補(bǔ)充[2］。維生素C 廣泛存在于新鮮水果及綠葉蔬菜中，尤以獼猴桃、板栗（生）、

6、草莓、橘子、刺梨及辣椒等含量豐富。中草藥如醋柳果、蒼耳子等也含有很多維生素C。</p><p>　　1.3 人體對維生素c的代謝</p><p>　　食物中的維生素C 可通過簡單擴(kuò)散或主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)迅速自胃腸道吸收。維生素C的吸收率隨攝入量增加而相對減少，如攝入100mg 以下幾乎100%吸收，若攝入200mg 僅吸收70%。現(xiàn)在醫(yī)學(xué)及營養(yǎng)保健專家主張小量多次的服用各種維生素C含片, 研究成果表

7、明每日可以達(dá)到500---1000mg 而無任何毒副作用。水楊酸類藥物可抑制維生素C 在胃腸道的吸收，增加維生素C 的排泄，長期服用此類藥物應(yīng)注意維生素C 的補(bǔ)充；而生物類黃酮、鈣和鎂同時(shí)作用，可使維生素C 發(fā)揮最大功效。</p><p>　　與其它眾多的水溶性維生素不同，有少量維生素C 貯藏在體內(nèi)， 人幾周內(nèi)不攝入維生素C 也不會(huì)出現(xiàn)壞血病癥狀。健康成人每100 毫升血漿含0.6 毫克抗壞血酸表明組織飽和，相當(dāng)

8、于體內(nèi)貯存了1500 毫克。吸收后的維生素C 廣泛分布于人體，其在各部的濃度大致與組織的代謝活動(dòng)相平行，沒有明顯的儲(chǔ)存，以腎上腺和腦垂體中維生素C 含量最高，肝、腎組織，脂肪組織內(nèi)含量最少。維生素C 在組織中以抗壞血酸和脫氧抗壞血酸兩種形式存在，但前者含量遠(yuǎn)高于后者，人血漿中為15∶1。維生素C 在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物主要為CO2和草酸，草酸隨尿排出體外。</p><p>　　1.4 維生素c的功用</p>

9、<p>　　1.4.1 維生素c的生理功用</p><p>　　維生素C有D型和L型兩異構(gòu)體，只有L型具有生理功能，維生素C的生理功能是多方面的：維生素C廣泛存在于植物和某些動(dòng)物體內(nèi)，但人體內(nèi)缺乏古龍酸內(nèi)酯氧化酶，因此人類自身不能合成維生素C，必須靠食物攝入，如長期缺乏人體將患上壞血病。歷史上，壞血病曾是造成人類死亡的嚴(yán)重疾病，長期危害人類健康。維生素C具有抗壞血病活性、是治療壞血病的有效藥物，因此

10、也被人們稱為抗壞血酸。</p><p>　　1.4.2 維生素c的主要功能與應(yīng)用</p><p>　　維生素C 具有一系列的生理功能，在歷史上曾有“萬能維生素”之譽(yù)，事實(shí)上雖然有些言過其實(shí)，但在一定程度上反映了維生素C 于人體健康方面的重要性。兩屆諾貝爾獎(jiǎng)獲得者，美國著名化學(xué)家林納斯?鮑林（Pauling）曾經(jīng)在“維生素與感冒”一書中，羅列了維生素C 的20 多種功能。概括而言，維生素C

11、的生理功能主要體現(xiàn)在以下10 個(gè)方面。</p><p>　　(1) 增強(qiáng)人體免疫功能</p><p>　　維生索C可促進(jìn)入體內(nèi)抗體的形成，提高白細(xì)胞的吞噬能力，提高人體對疾病的抵抗力和對寒冷的耐受力，從而增強(qiáng)人體的免疫功能。</p><p>　　(2) 預(yù)防和治療缺鐵性貧血</p><p>　　食物中鐵存在的離子形式包括Fe2+ 和Fe3+2

12、 種，人體能夠吸收的只有 Fe2+。鐵是合成血紅細(xì)胞的重要材料，人體缺鐵可患缺鐵性貧血癥（IDA），又稱營養(yǎng)性貧血。維生素C具有較強(qiáng)的還原性，可將食物中的Fe3+還原成Fe2+，促進(jìn)食物鐵在腸道內(nèi)的吸收，有利于預(yù)防和治療缺鐵性貧血（IDA）。</p><p>　　(3) 預(yù)防和治療惡性貧血</p><p>　　人體缺乏葉酸（VB11）時(shí)可患惡性貧血（巨幼紅細(xì)胞性貧血）。葉酸對氧較為敏感，而

13、維生素C具有較強(qiáng)的還原性（抗氧化性），一方面，維生素C的存在對葉酸具有保護(hù)功效，可以減少葉酸在烹調(diào)加工過程中的損失，提高膳食中葉酸的有效供應(yīng)量；另一方面，維生素C可將葉酸（F）還原成具有生物活性的四氫葉酸（FH4），促進(jìn)葉酸的活化。維生素C對葉酸可發(fā)揮保護(hù)及活化等雙重作用，從而有利于預(yù)防和治療惡性貧血（巨幼紅細(xì)胞性貧血）。</p><p>　　(4) 預(yù)防和治療壞血病</p><p>　　

14、人體輕度缺乏維生素C時(shí)，早期癥狀表現(xiàn)為感覺疲勞、牙齦出血等，嚴(yán)重缺乏維生素C 時(shí)，則可導(dǎo)致壞血病。保證膳食中維生素C 的足量供應(yīng)，有利于預(yù)防和治療壞血病。</p><p>　　(5) 促進(jìn)膠原的形成和類固醇的代謝</p><p>　　一方面，膠原是含有大量羥脯氨酸和羥賴氨酸的纖維狀蛋白質(zhì)，它們分別是由脯氨酸和賴氨酸羥基化所形成的。維生素C的作用在于活化脯氨酸羥化酶和賴氨酸羥化酶，促進(jìn)脯氨酸

15、和賴氨酸向羥脯氨酸和羥賴氨酸的轉(zhuǎn)化［3］，進(jìn)而促進(jìn)組織細(xì)胞間質(zhì)中膠原的形成。另一方面，維生索C 可參與類固醇的羥基化反應(yīng)，如促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸、皮質(zhì)激素及性激素等。</p><p>　　(6)有利于維持骨骼和牙齒的正常功能</p><p>　　維生索C是一種酸性化合物，可在消化道中形成酸性介質(zhì)，能防止不溶性鈣絡(luò)合物的生成，促進(jìn)膳食鈣的吸收；維生素C還可進(jìn)一步促進(jìn)鈣在骨骼和牙齒中的沉積，

16、有利于維持骨骼和牙齒的正常功能。</p><p>　　(7)有利于維持細(xì)胞膜的完整性</p><p>　　人體內(nèi)的不飽和脂肪酸（UFA）易被氧化而生成脂性過氧化物，可使各種細(xì)胞膜破裂。還原性谷胱甘肽（G-SH）可使脂性過氧化物還原成羥基化合物，自身轉(zhuǎn)變成氧化型谷胱甘肽（GS-SG），從而消除脂性過氧化物對細(xì)胞膜的破壞作用。維生素C 具有較強(qiáng)的還原性（抗氧化性），在谷胱甘肽還原酶的作用下，可

17、使GS-SG還原為G - S H［3 ］。</p><p>　　(8) 對某些有毒物質(zhì)具有解毒作用</p><p>　　鉛化物、砷化物、苯、細(xì)菌毒素等是日常膳食中常見的有毒有害物質(zhì)，對人體健康存在潛在危害。當(dāng)致毒劑量的鉛化物、砷化物、苯以及細(xì)菌毒素等進(jìn)入人體內(nèi)時(shí)，充足的維生素C 有利于緩解其毒性［2］，從而降低這些有害物質(zhì)對人體健康的危害程度。</p><p>　　

18、(9) 具有抗衰老作用</p><p>　　科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，自由基和過氧化脂質(zhì)是人體衰老的重要誘因。充足的維生素 C 可抑制體內(nèi)自由基、過氧化脂質(zhì)等有害物質(zhì)的形成，從而延緩人體的衰老。</p><p>　　(10) 具有防癌抗癌作用</p><p>　　亞硝基化合物是食物中存在的一類重要的致癌物質(zhì)，其中尤以亞硝胺的致癌性最為突出。維生素C具有較強(qiáng)的還原性，可阻斷亞硝基

19、化進(jìn)程，抑制亞硝胺的形成，有利于預(yù)防胃癌、腸癌等消化道癌癥。維生素C還可促進(jìn)膠原蛋白抗體的形成，膠原蛋白可包圍癌細(xì)胞，從而表現(xiàn)出抗癌作用。</p><p>　　1.5維生素c的生產(chǎn)的發(fā)展簡史</p><p>　　維生索c的天然來源是薔薇果品、柑桔果品及綠色蔬菜，從它被作為還原性因子(Reducing factor)，由動(dòng)植物器官組織中濃縮分離開始，即迅速進(jìn)入商品化生產(chǎn)。1934年全世界維生

20、素C產(chǎn)量僅為50公斤，60年代中期，全世界維生素c的年生產(chǎn)量已達(dá)5000噸，1979年美國維生素c產(chǎn)量突破萬噸，而全世界維生素C總產(chǎn)量達(dá)到32750噸，1994年全世界維生素C生產(chǎn)能力近8．5萬噸，2002年達(dá)到歷史最高水平12萬噸。維生素C的工業(yè)化生產(chǎn)從其歷史發(fā)展進(jìn)程看可劃分為濃縮提取、化學(xué)合成和細(xì)菌發(fā)酵三個(gè)階段。</p><p>　　1.5.1 濃縮提取法</p><p>　　本世紀(jì)的

21、二、三十年代，人們對于維生素C的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)還不了解，獲取其產(chǎn)品的途徑只是經(jīng)驗(yàn)性地由富含“還原性因子”的生物組織如檸檬、胡桃、野薔薇、辣椒、腎上腺等提取獲得“刪。此法生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類社會(huì)日益增長的物質(zhì)需求。直至五十年代，仍有企業(yè)使用此法生產(chǎn)維生素C。</p><p>　　1.5.2 化學(xué)合成</p><p>　　1933年，Reichstein等和Ault等兩個(gè)研究小組

22、分別獨(dú)立發(fā)表了維生素c的合成方法。從1937年開始，以Reichstein和Grussner的發(fā)明為基礎(chǔ)，建立了以D-葡萄糖為原料，加氨還原成D-山梨醇，然后利用一步發(fā)酵方法和化學(xué)方法合成維生素C的“萊氏法”(Reichstein Procedure)，維生素C生產(chǎn)開始進(jìn)入化學(xué)合成階段。“萊氏法”生產(chǎn)的工藝流程主要包括以下五個(gè)步驟：</p><p>　　1)D-葡萄糖在鎳的催化作用下，高溫高壓，加氫還原成D-山梨

23、醇；</p><p>　　2)D-山梨醇經(jīng)微生物如生黑葡萄糖酸桿菌(Giuconobacter melanogenus)或弱氧化醋酸桿菌(Acetobater suboxydans)發(fā)酵氧化成L-山梨糖；</p><p>　　3)L-山梨糖在丙酮和硫酸的作用下，經(jīng)酮化生成雙丙酮-L-山梨糖(Diacetone-L—sorbose簡稱雙酮糖)，生產(chǎn)上俗稱丙酸化。再用苯或甲苯提取，提取液經(jīng)水法

24、除去單酮山梨糖后，蒸去溶劑而后分離出雙酮糖；</p><p>　　4)雙酮糖在高錳酸鈉氧化，鉑催化下，經(jīng)水解生成2-酮基-L-古龍酸(2-Keto—L—gulonic acid)；</p><p>　　5)2-酮基-卜古龍酸通過烯醇化和內(nèi)酯化，在酸性或堿性條件下，轉(zhuǎn)化生成維生素C。</p><p>　　“萊氏法”工藝應(yīng)用于大生產(chǎn)的早期，從D-山梨醇到維生素C的總收率

25、僅為15—18％。此后經(jīng)過不斷的工藝優(yōu)化，目前總收率已達(dá)到60—65％。由于葡萄糖為大宗原料，便宜易得，中間體尤其是雙丙酮-L-山梨糖的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，以及工藝流程的不斷改進(jìn)，且產(chǎn)品質(zhì)量好，收率較高，目前在國外發(fā)達(dá)國家仍為維生素C生產(chǎn)的主要工藝”。主要采用“萊氏法”生產(chǎn)的公司包括：瑞士Hoffmann—La—Roche(2003年1月維生素業(yè)務(wù)轉(zhuǎn)讓荷蘭帝斯曼公司)，德國BASF和E．Merck。但是，“萊氏法”仍存在著許多不足之處：生產(chǎn)工

26、序復(fù)雜，工藝路線較長，較難連續(xù)化操作，勞動(dòng)強(qiáng)度大，耗費(fèi)大量有毒、易燃化學(xué)藥品，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染等。自六十年代以來，各國研究機(jī)構(gòu)對“萊氏法”工藝改進(jìn)作了大量的研究工作，試圖簡化或以生物氧化法替代以化學(xué)合成為主的“萊氏法”，現(xiàn)在許多重要研究成果已經(jīng)在大生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。</p><p><b>　　1.5.3生物發(fā)酵</b></p><p>　　六十年代以后，各國生產(chǎn)企業(yè)

27、及科學(xué)家開始探索以細(xì)菌生物酶轉(zhuǎn)化的方法來取代“萊氏法”，相繼提出了諸多反應(yīng)路線，并在此基礎(chǔ)上對有關(guān)反應(yīng)工藝的問題進(jìn)行了探索。已成功應(yīng)用于大生產(chǎn)的細(xì)菌發(fā)酵法是我國七十年代初開發(fā)的“二步發(fā)酵法”。由中國科學(xué)院微生物研究所、北京制藥廠、東北制藥總廠尹光琳、寧文珠等人發(fā)明的“二步發(fā)酵法”從七十年代后期開始正式投產(chǎn)，逐漸在國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)普遍采用，現(xiàn)在國內(nèi)四大維生素C生產(chǎn)企業(yè)都采用此法。二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C的新工藝1980年獲得國家級二等獎(jiǎng)。“二步

28、發(fā)酵法”已經(jīng)在中國、歐洲、日本和美國申請了專利，上海三維制藥有限公司當(dāng)時(shí)具有堅(jiān)實(shí)的科研開發(fā)力量，1985年成功地將維生素C二步發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)讓給FHoffmann-la Roche Ltd．，Switzorland(瑞士豪大邁一羅氏公司)，成為建國以來最大的一項(xiàng)醫(yī)藥技術(shù)出口項(xiàng)目。該法應(yīng)用于大生產(chǎn)初時(shí)，從D-山梨醇到維生素C的總收率平均為百分之四十多，但經(jīng)過近幾年的激烈市場競爭后，一些廠家可超過百分之六十五，最高為72％。“二步發(fā)酵法”的工藝

29、路線與“萊氏法”不同之處在于采用大、小混合菌發(fā)酵法代替化學(xué)法轉(zhuǎn)化卜山梨糖合成2-酮基-L-古龍</p><p>　　Huang等人于1962年首次發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(Pseudomonas)的某些種具有氧化L-山梨糖積累2-酮基-L-古龍酸的能力，不過其產(chǎn)酸量僅為lg／L(發(fā)酵液含</p><p>　　糖為20g／L)。此后相繼發(fā)現(xiàn)了不少具有此氧化能力的細(xì)菌，但糖酸轉(zhuǎn)化率均非常低?！岸桨l(fā)酵法

30、”轉(zhuǎn)化L_山梨糖合成2-酮基-L-古龍酸用的大小菌：產(chǎn)酸菌為氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxans)(俗稱小菌)，巨大芽孢桿菌(俗稱大菌)最初為條紋假單胞菌(Ps.striata)，目前生產(chǎn)上大菌大多數(shù)企業(yè)使用芽孢桿菌(Bacillus spp)。最初從L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸的轉(zhuǎn)化率僅為39．7％(濃糖度7％，6天)，經(jīng)過多方面的改進(jìn)，發(fā)酵時(shí)間已經(jīng)縮短至35—60小時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)82％左右，目前工廠最好已超過8

31、5％(發(fā)酵液含酸量8—10%)。</p><p>　　“二步發(fā)酵法”的第一步L_山梨糖發(fā)酵與“萊氏法”相同，其七十年代曾發(fā)現(xiàn)有染噬菌體現(xiàn)象，經(jīng)過篩選獲得抗噬菌體菌體，在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用于生產(chǎn)上己近二十年，糖酸轉(zhuǎn)化率一直保持在98％以上，且遺傳特性穩(wěn)定。</p><p>　　“二步發(fā)酵法”盡管比“萊氏法”在工藝流程上有了極大改進(jìn)，但此法仍需以D-山梨糖為底物，大生產(chǎn)發(fā)酵過程包括三種菌，菌種操作

32、通常比其它生物發(fā)酵工藝繁瑣，易于污染雜菌：第二步發(fā)酵涉及大小菌株的混合發(fā)酵，其產(chǎn)酸小菌單獨(dú)培養(yǎng)產(chǎn)酸率低，且難以穩(wěn)定傳代，必須要有適宜的大(伴生)菌搭配。為了適應(yīng)日益激烈的維生素c市場的要求，我國各生產(chǎn)企業(yè)非常有必要及時(shí)尋求開發(fā)對自身發(fā)展有利的“二步發(fā)酵法”工藝流程的簡化或優(yōu)化。</p><p>　　1.6 兩部發(fā)酵生產(chǎn)古龍酸的反應(yīng)機(jī)理（圖2）</p><p>　　圖2 兩部發(fā)酵的生產(chǎn)古龍酸

33、的反應(yīng)機(jī)理</p><p>　　1.7 維生素c的市場動(dòng)態(tài)</p><p>　　1.7.1 VC的生產(chǎn)概況</p><p>　　1934年，全世界vc年產(chǎn)量僅為50kg，60年代中期達(dá)到5000t，到1995年突破了lO萬t大關(guān)。我國東北制藥總廠和華北制藥集團(tuán)的萬t VC項(xiàng)目投產(chǎn)后，世界VC市場的競爭達(dá)到了白熱化的狀態(tài)。近幾年全球VC市場的實(shí)際銷售量約為每年9~10

34、萬t，而世界VC總生產(chǎn)能力已超過15萬t，因此大部分VC生產(chǎn)企業(yè)的開工率嚴(yán)重不足。</p><p>　　1.7.1.1國內(nèi)生產(chǎn)狀況</p><p>　　從1958年東北制藥總廠首先投產(chǎn)VC，到上世紀(jì)70年代初我國首創(chuàng)的VC二步發(fā)酵法新工藝試產(chǎn)成功，我國的vc生產(chǎn)已經(jīng)經(jīng)歷了四十余年的發(fā)展，逐漸確立了世界VC生產(chǎn)大國的地位?！傲濉蹦┢?，我國的VC年產(chǎn)量不足4000t。1992年下半年起，由于

35、波黑戰(zhàn)爭的加劇以及甘本Takeda公司遭受強(qiáng)臺風(fēng)襲擊等原因，使得國際市場上VC明顯俏銷?；诔隹诘拇碳?，1993年我國的VC生產(chǎn)能力達(dá)到1．5萬t，產(chǎn)量達(dá)到1．2萬t。1996年生產(chǎn)能力則達(dá)到5萬t以上，產(chǎn)量為2．6萬t，生產(chǎn)能力在1993年的基礎(chǔ)上翻了近兩番，產(chǎn)量亦翻了一番。目前，我國vc年產(chǎn)量已經(jīng)接近5萬t。據(jù)報(bào)道，石家莊制藥集團(tuán)將在2004年4月份建成年生產(chǎn)能力3萬t的VC生產(chǎn)線。</p><p>　　VC

36、是我國最主要的出口創(chuàng)匯原料藥之一。國內(nèi)vc生產(chǎn)廠家較多，生產(chǎn)規(guī)模較大的為：華北制藥集團(tuán)維爾康制藥有限公司、東北制藥總廠、石家莊制藥集團(tuán)維生藥業(yè)有限公司、江蘇江山制藥有限公司。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2003年上半年我國共向63個(gè)國家和地區(qū)出口VC產(chǎn)品，總出口量約2．4萬t，主要出口區(qū)域?yàn)闅W盟、北美、韓國和日本等。</p><p>　　1.7.1.2 國外生產(chǎn)狀況</p><p>　　國外最早的VC生產(chǎn)始于

37、1938年。此后，VC市場一直看好，許多公司競相建廠投產(chǎn)。目前，全球約有10個(gè)國家建有vc生產(chǎn)裝置，主要分布于歐洲、亞洲和美洲。國外生產(chǎn)商主要采用萊氏法生產(chǎn)VC，年生產(chǎn)能力總計(jì)6萬t左右。1986年，Roche公司以550萬美元的價(jià)格從我國購買了二步發(fā)酵法生產(chǎn)VC的技術(shù)。</p><p>　　上世紀(jì)80年代，VC價(jià)格大戰(zhàn)一度使Roche公司和Takeda公司等國外VC生產(chǎn)商陷入窘境，但是這些大跨國公司憑借其雄厚財(cái)

38、力，至今仍相對輕松地活躍在世界vc市場上。1998年1月份，Roche公司向其在蘇格蘭Daly的vc工廠投資約2．03億美元，用于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模；2000年初．Roche公司再次擴(kuò)大了該廠的生產(chǎn)規(guī)模。1997年，BASF公司、默克公司以及Cerestar公司合作創(chuàng)辦了一家專門生產(chǎn)VC合成關(guān)鍵中間體——2-氧代古洛糖酸的合資企業(yè)，總耗資3000萬美元，由Cerestar公司負(fù)責(zé)提供起始生產(chǎn)原料——山梨醇。2000年9月，美國伊斯特曼化學(xué)品公

39、司與另外4家企業(yè)一道完成了一種抗壞血酸生產(chǎn)新工藝的研發(fā)工作，顯著降低了VC生產(chǎn)成本，并很快應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。</p><p>　　多年來，Roche公司、BASF／Takeda公司與我國的四大VC生產(chǎn)商始終牢牢掌握著世界vc市場的命脈。BASF／Takeda公司和Roehe公司兩大集團(tuán)的VC生產(chǎn)能力合計(jì)約為6萬t，而實(shí)際產(chǎn)量可能只占生產(chǎn)能力的60％。</p><p>　　1.8 維生素c的科

40、研動(dòng)態(tài)</p><p>　　1.8.1 維生素c的新作用</p><p>　　自從人們發(fā)現(xiàn)維生素C具有防治感冒功能以來,已有近三十年的歷史。自此以后,國內(nèi)外研究人員又對其進(jìn)行了不懈探索,發(fā)現(xiàn)維生素C還有更多的功效。</p><p>　　1）新的研究發(fā)現(xiàn),維生素C在試管內(nèi)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都能抑制引起胃潰瘍的幽門螺旋桿菌生長</p><p>　　2）

41、法國一家醫(yī)院研究發(fā)現(xiàn),適量服用維生素C可以有效抑制尼古丁依賴者的吸煙欲望,甚至可以幫助他們逐漸戒除煙癮。</p><p>　　3）最近美國加州的研究人員發(fā)現(xiàn),攝人大劑量的維生素C可以降低血液中過高的鉛含量,血鉛水平過高是影響兒童健康的一個(gè)主要因素。</p><p>　　4）美國亞拉巴馬大學(xué)的研究人員最近說,因維生素C可以減少機(jī)體緊張的程度,能夠預(yù)防感冒和癌癥等一系列疾病。</p>

42、;<p>　　5）美國加利福尼亞大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn),血中維生素C濃度高的女性與濃度低的相比,前者發(fā)生膽石癥的比例減半。</p><p>　　6）最近《美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志》指出,服用更大劑量的維生素C,會(huì)有助于預(yù)防諸如癌癥、心血管疾病和白內(nèi)障之類的慢性病。</p><p>　　7）最近,英國倫敦醫(yī)院的研究人員發(fā)現(xiàn),富含維生素C的飲食,有助于防止心肌梗死、腦卒中的發(fā)生,特別是在冬

43、季</p><p>　　8）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)維生素C對血小板具有有效的保護(hù)作用。</p><p>　　9）維生素C有糾正婦女陰道菌群失調(diào)癥作用。</p><p>　　1.8.2 維生素c生產(chǎn)方法的研究方向</p><p>　　VC是我國自主知識產(chǎn)權(quán)開發(fā)的首批西藥之一，也是我國最主要的出口創(chuàng)匯原料藥之一。二步發(fā)酵法是我國VC生產(chǎn)的主要工藝方法，然而該法

44、不能直接以葡萄糖為發(fā)酵原料，且涉及二步發(fā)酵三種菌，工序繁瑣。采用基因工程等先進(jìn)技術(shù)，選育直接以葡萄糖為發(fā)酵原料的優(yōu)良菌株和優(yōu)化發(fā)酵條件將是我國VC生產(chǎn)技術(shù)研究的主要方向。</p><p>　　此外，目前世界上很多國家正嘗試以真核生物為研究對象，利用它們合成VC的代謝途徑開發(fā)更加環(huán)保的生物合成方法。從我國的二步發(fā)酵法推廣后逐步取代萊氏法這一過程可以預(yù)測，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和更具優(yōu)勢的生物合成VC方法的不斷涌現(xiàn)，

45、生物法必將完全取代化學(xué)法在VC生產(chǎn)中的地位。為了保持我國在世界VC生產(chǎn)上的優(yōu)勢地位，必須加強(qiáng)VC生產(chǎn)的基礎(chǔ)研究工作。</p><p>　　2 設(shè)計(jì)的內(nèi)容和依據(jù)</p><p><b>　　2.1 設(shè)計(jì)題目</b></p><p>　　二步發(fā)酵法年產(chǎn)30000噸古龍酸的初步工藝設(shè)計(jì)。</p><p><b>　　

46、2.2 設(shè)計(jì)依據(jù)</b></p><p>　　河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院生物工程系下達(dá)的2011屆畢業(yè)設(shè)計(jì)任務(wù)書。</p><p><b>　　2.3 設(shè)計(jì)內(nèi)容</b></p><p>　　古龍酸的發(fā)酵、提取。</p><p>　　2.3.1 編寫設(shè)計(jì)說明書</p><p><

47、;b>　?、購S址選擇及論證</b></p><p>　　②古龍酸的生產(chǎn)工藝確定及論證</p><p>　?、凵a(chǎn)物料衡算及列表</p><p>　?、芩?、電、氣、熱量平衡計(jì)算</p><p>　?、莨琵埶岬陌l(fā)酵、提取主要設(shè)備選型及計(jì)算，并列出一覽表</p><p>　　2.3.2 設(shè)計(jì)圖紙</p

48、><p><b>　?、購S平面布置圖1張</b></p><p><b>　　②工藝流程圖2張</b></p><p>　?、凵a(chǎn)車間設(shè)備布置圖2張</p><p>　?、軣o菌空氣制備流程圖1張</p><p><b>　　3 場址選擇</b></p&

49、gt;<p><b>　　3.1地區(qū)選擇</b></p><p>　　廠址選擇首先要進(jìn)行建廠地區(qū)的選擇。生物發(fā)酵工廠建廠地區(qū)的選擇應(yīng)當(dāng)有利于發(fā)酵工業(yè)的合理布局，有利于地區(qū)經(jīng)濟(jì)和國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，應(yīng)當(dāng)考慮合理利用現(xiàn)有的工業(yè)基地和交通運(yùn)輸條件，或適應(yīng)新工業(yè)基地和中小城鎮(zhèn)建設(shè)的需要，考慮生產(chǎn)和技術(shù)協(xié)作的條件，為原材料供應(yīng)、產(chǎn)品配套、工藝協(xié)作、科學(xué)技術(shù)協(xié)作和信息交流等創(chuàng)造有利條件。<

50、;/p><p>　　3.2 場址選擇的總原則</p><p>　　場址選擇的總原則是：</p><p>　　第一，場址選擇必須符合工業(yè)布局、符合所在地區(qū)、城市規(guī)劃的要求，按照國家有關(guān)法律法規(guī)及建設(shè)前期工作的規(guī)定進(jìn)行。</p><p>　　第二，充分利用各地區(qū)的有利條件，避開或客服不利條件，充分利用當(dāng)?shù)厝肆?、物力、?cái)力和自然資源，保護(hù)環(huán)境，節(jié)約用地

51、，不占用良田及經(jīng)濟(jì)效益高的土地，并符合國家現(xiàn)行土地管理、環(huán)境保護(hù)、水土保持等法規(guī)有關(guān)規(guī)定。盡量遠(yuǎn)離風(fēng)景游覽區(qū)和自然保護(hù)區(qū)，不污染水源，有利于三廢處理，并符合現(xiàn)行環(huán)境保護(hù)法規(guī)規(guī)定。</p><p>　　第三，使企業(yè)接近原料、能源產(chǎn)地和產(chǎn)品消費(fèi)區(qū)，消除不合理運(yùn)輸，總體經(jīng)濟(jì)效益好，有利于加快國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的提高。</p><p><b>　　3.3廠址論證</b>

52、;</p><p>　　該廠選址位于石家莊藁城縣，藁城市地處河北省西南部，省會(huì)石家莊市東側(cè)。境域在東經(jīng)114º39ˊ～114º59ˊ，北緯37º51ˊ～38º18ˊ之間。轄區(qū)總面積836平方公里。北鄰新樂市，南接趙縣境，東與晉州市相連，西與石家莊、正定搭界，東北與無極接壤，西南與欒城毗鄰。市治西距石家莊市31公里，北至首都北京264公里。</p><p&

53、gt;<b>　　3.3.1地勢地貌</b></p><p>　　藁城市處于太行山東麓河北平原中南部，屬太行山洪積沖積山前傾斜平原。地勢西北高東南低，以1/1500～1/2000的坡降逐漸傾斜，形成典型的山前傾斜平原地貌。境域中部為滹沱河第二沖積扇之脊，地勢較南北兩面略為低洼；北部為磁河沖積扇及磁河、滹沱河之間的河間地帶，海拔65～55米，向東南緩降；南部邊緣為滹沱河、槐河之間的河間地帶，海

54、拔60～39米，向東南緩傾。由于歷史上滹沱河、磁河、槐河等河流的改道和變遷，洪水泛濫、風(fēng)沙等外力作用，形成只都、九門、南董一帶，楊馬村至南孟、梁家莊一帶，張村、北樓、小常安、賈市莊一帶的古河道、洼地、沙崗、沙丘、緩崗、河溝、坑塘等微地貌。20世紀(jì)60年代以后，通過治沙治水平地造田等，使沙崗、河溝、古河道得以治理，逐漸塑造成藁城大地平曠開闊的現(xiàn)狀。</p><p><b>　　3.3.2 氣候</b

55、></p><p>　　藁城氣候?qū)倥瘻貛О霛駶櫞箨懶约撅L(fēng)氣候。由于地處平原，地勢、地貌對氣候影響不大，氣候因素分布比較均勻，表現(xiàn)為冬冷夏熱的氣候特點(diǎn)。全境四季分明，春季干燥多風(fēng)，夏季炎熱多雨，秋季氣溫涼爽，冬季寒冷雨雪稀少。年平均氣溫12.5℃，年極端高溫43.2℃（1961年6月12日），年極端低溫―23.4℃（1985年12月8日）。1月份最冷月平均氣溫―3.5℃，7月份最熱月平均氣溫26.4℃。年平均

56、降水量494毫米，年最大降水量為1007.1毫米（1963年）。7-8月份降水量最多，約占全年的56.2%。年平均太陽輻射總量546.5千卡/平方厘米，年日照時(shí)數(shù)2711.4小時(shí)，日照率61.2%。無霜期190天。</p><p>　　3.3.3 經(jīng)濟(jì)發(fā)展?fàn)顩r</p><p>　　藁城市緊緊圍繞“富民強(qiáng)市、社會(huì)和諧穩(wěn)定”的施政目標(biāo)，以科學(xué)發(fā)展觀統(tǒng)領(lǐng)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展全局，按照建設(shè)“省會(huì)最大生態(tài)精

57、品衛(wèi)星城”的城市功能定位、“一城三區(qū)八園”的空間布局定位、“省會(huì)產(chǎn)業(yè)制造中心和綜合性經(jīng)濟(jì)區(qū)”的產(chǎn)業(yè)發(fā)展三個(gè)定位，大力發(fā)展“城郊型”經(jīng)濟(jì)，全力打造“實(shí)力藁城、活力藁城、魅力藁城、誠信藁城”四張城市名片，經(jīng)濟(jì)持續(xù)快速健康發(fā)展。綜合經(jīng)濟(jì)實(shí)力連年位居河北省十強(qiáng)縣（市）行列，2004年首次躋身全國縣域經(jīng)濟(jì)基本競爭力百強(qiáng)，2006年在全國最具發(fā)展?jié)摿χ行〕鞘邪購?qiáng)評比中名列第20位。2006年，實(shí)現(xiàn)地區(qū)生產(chǎn)總值173.6億元，人均23470萬元，同比

58、增長14.2%。財(cái)政收入完成80118萬元，同比增長13.59%。民營經(jīng)濟(jì)實(shí)現(xiàn)增加值132億元，占全市GDP的76%。城鎮(zhèn)居民可支配收入和農(nóng)民人均純收入分別達(dá)到9841元和5465元，比上年分別增加910元和405元。</p><p>　　農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá) 藁城市是全國知名的傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)大市，農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力保持全省、全國領(lǐng)先水平。2004—2006年連年榮獲“全國糧食生產(chǎn)先進(jìn)縣標(biāo)兵”第一名。2006年，完成一產(chǎn)增加值3

59、4億元，糧食播種面積達(dá)到99.7萬畝，糧食總產(chǎn)50.4萬噸，蔬菜種植面積53萬畝，總產(chǎn)267萬噸。肉、蛋、奶總產(chǎn)量達(dá)到39萬噸，養(yǎng)殖總量和綜合指標(biāo)排名位居河北省前列。農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化水平不斷提高，擁有5家省級重點(diǎn)龍頭企業(yè)、 72家銷售收入500萬元以上龍頭企業(yè)、5家超億元企業(yè)。2005年6月和2006年2月，溫家寶總理和回良玉副總理先后到藁城視察，對藁城農(nóng)業(yè)給予了充分肯定。</p><p>　　工業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速 以園區(qū)

60、經(jīng)濟(jì)和項(xiàng)目建設(shè)為抓手，深入實(shí)施工業(yè)強(qiáng)市戰(zhàn)略，形成了較為完善的工業(yè)經(jīng)濟(jì)體系。園區(qū)集群效應(yīng)明顯，省級石家莊經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)、石家莊循環(huán)經(jīng)濟(jì)化工示范基地和藁城新區(qū)聚集了全市90%以上的大型企業(yè)，形成高度聚集的機(jī)械制造、化工、板材、輕紡、醫(yī)藥、禽蛋產(chǎn)銷和農(nóng)產(chǎn)品加工等七大主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。擁有鏈霉素產(chǎn)量世界第一的華勝制藥公司、半合抗原料藥產(chǎn)量亞洲第一的華藥倍達(dá)公司、全國最大無公害生物獸藥生產(chǎn)企業(yè)愛諾藥業(yè)和金剛石鋸片產(chǎn)量居全國首位的冀凱集團(tuán)等多個(gè)世界馳名企業(yè)

61、。項(xiàng)目建設(shè)連創(chuàng)新高，2006年，社會(huì)固定資產(chǎn)投資完成61億元，建設(shè)投資超500萬元項(xiàng)目128個(gè)，其中78個(gè)超千萬元項(xiàng)目、12個(gè)超億元項(xiàng)目，有15個(gè)項(xiàng)目列入省市重點(diǎn)計(jì)劃，數(shù)量位居石家莊各縣市之首。2006年，完成工業(yè)增加值90億元，占全市GDP的51.4%。規(guī)模以上工業(yè)企業(yè)完成增加值52.1億元、實(shí)現(xiàn)利稅18.86億元，同比分別增長33.8 %和37%。</p><p>　　現(xiàn)代服務(wù)業(yè)蓬勃發(fā)展 以市場建設(shè)為龍頭，全

62、市商貿(mào)流通業(yè)快速發(fā)展，形成了比較完善的商貿(mào)流通體系。擁有河北省惟一一家具有“一關(guān)三檢”功能的石家莊內(nèi)陸港及華北地區(qū)最大的系井糧食現(xiàn)貨交易市場、北方最大的藁城禽蛋交易市場等12個(gè)農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場，年交易額達(dá)到23億元。通過深入實(shí)施“萬村千鄉(xiāng)“市場工程，農(nóng)村超市遍布全市239個(gè)村。2006年，完成三產(chǎn)增加值52.5億元，同比增長12.6%；社會(huì)消費(fèi)品零售總額完成45.6億元，同比增長14.95%。</p><p>　　

63、4 工藝流程設(shè)計(jì)及工藝論證</p><p>　　4.1 本設(shè)計(jì)采用二步發(fā)酵法生產(chǎn)古龍酸生產(chǎn)工藝流程</p><p>　　二步發(fā)酵法的工藝流程如下：</p><p>　　4.2 工藝選擇及論證</p><p>　　4.2.1 一步發(fā)酵</p><p>　　4.2.1.1 菌種</p><p>

64、;　　本設(shè)計(jì)中一步發(fā)酵采用的菌種為生黑葡萄糖酸桿菌，簡稱黑醋菌。最常用的生產(chǎn)菌株為R-30，其主要特征是細(xì)胞呈橢圓至短桿狀，革蘭氏染色陽性，無芽孢大小為(0.5～0.8)×(1.0～2.2)µm，端生鞭毛。菌落邊緣整齊，微顯淺褐色。生長最適溫度為34℃，氧化D-山梨醇的發(fā)酵收率可達(dá)98％以上。2.2.1.2 培養(yǎng)基</p><p>　　4.2.1.2.1 培養(yǎng)基</p>&l

65、t;p>　　一步一級種子培養(yǎng)基成分（100g水）：山梨醇 2g，酵母膏 0.7g，蛋白胨 0.8g，玉米漿 0.7g，碳酸鈣 0.15g，MgSO4 0.02g， KH2PO4 0.1g。</p><p>　　一步二級種子培養(yǎng)基成分（100g水）：山梨醇 2g，酵母膏 0.5g，尿素 0.1g，玉米漿 0.3g，碳酸鈣 0.15g，MgSO4 0.02g， KH2PO4 0.1g。</p>

66、<p>　　一步發(fā)酵液培養(yǎng)基成分（100g水）：山梨醇 20g，酵母膏 0.5g，尿素 0.1g，玉米漿 0.3g，碳酸鈣 0.1g。</p><p>　　4.2.2 二步發(fā)酵</p><p>　　4.2.2.1 菌種</p><p>　　本設(shè)計(jì)中二步發(fā)酵采用的菌種為大、小菌的混合菌，小菌為氧化葡萄糖酸桿菌，大菌可采用巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌(Baci

67、llus cereus)或浸麻芽孢桿菌(Bacillus macerans)。</p><p>　　小菌形態(tài)特征為細(xì)胞橢圓至短桿狀，革蘭氏染色陰性，無芽孢，0.3～0.7×0.6～1.2µm ，單個(gè)或成對排列。菌落呈圓點(diǎn)狀，表面微突起，邊緣整齊，無色透明。最適生長溫度25～30℃。 大菌的形態(tài)特征為桿狀，端圓，革蘭氏染色陽性，無芽孢，單個(gè)或成對排列，0.4×1.0～1.8 µ

68、;m，菌落具紫色熒光，光滑。最適生長溫度28～37℃。 </p><p>　　混合發(fā)酵中大菌和小菌的關(guān)系：在大、小菌的混合培養(yǎng)中,兩者的增殖是同步進(jìn)行的。小菌是2 - KL G 合成的主體,大菌一方面直接參與2 - KLG 的合成過程,一方面對小菌的生長起促進(jìn)作用。小菌合成的2 - KLG對大菌的生長增殖有明顯的抑制作用,而大菌的存在卻是小菌的生長增殖和合成2 - KLG所必需的。深入研究發(fā)現(xiàn),大菌的胞內(nèi)液和胞

69、外液均可促進(jìn)小菌的生長,大菌胞外液中具有該作用的組分的分子量在100kD 以上。此外,胞外液還具有促進(jìn)小菌轉(zhuǎn)化I - 山梨糖生成2 - KLG的作用,具有該作用的組分包括30 - 50kD 和大于100kD 兩部分,其中前者系一種含鐵和鋅的蛋白質(zhì)。二者必須保持適當(dāng)?shù)谋壤Ｆ浔壤ǔ榇缶?小菌＝1：1.2～1.4。</p><p>　　4.2.2.2 培養(yǎng)基</p><p>　　二步一級種

70、子培養(yǎng)基成分：酵母膏0.3％，牛肉膏0.3％，玉米漿0.3％，蛋白胨1.0％，尿素0.1％，山梨糖2.0％，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.02%，碳酸鈣0.1%。</p><p>　　二步二級種子培養(yǎng)基成分：酵母膏0.6％，牛肉膏0.4％，玉米漿0.5％，蛋白胨1.0％，尿素0.1％，山梨糖6.0％，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.02%，碳酸鈣0.1%。</p><p>　　二步發(fā)酵液培養(yǎng)

71、基成分為：玉米漿1.5％，尿素1.2％，L-山梨糖8%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.01%，碳酸鈣0.5%。</p><p><b>　　4.3 滅菌</b></p><p>　　培養(yǎng)基配成后首先要滅菌，滅菌是否徹底，關(guān)系到生產(chǎn)的成敗，因污染會(huì)使發(fā)酵受到重大的損失。因此，培養(yǎng)基滅菌是保證生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。然而高溫雖然能殺死培養(yǎng)基中的雜菌，但也會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，

72、甚至產(chǎn)生不利于菌體生長的物質(zhì)。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中，除了盡可能殺死培養(yǎng)基中的雜菌外，還要盡可能的減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的損失。</p><p>　　培養(yǎng)基滅菌的基本方法比較多，可以利用化學(xué)藥品殺滅培養(yǎng)基中的雜菌，但培養(yǎng)基中會(huì)有殘留的藥品；電磁波、射線、射線、聲波輻射等殺菌僅在實(shí)驗(yàn)上小規(guī)模有效；蒸汽滅菌沒有毒性物質(zhì)遺留，蒸汽的取得也比較容易，操作也比較方便，故適用于大規(guī)模的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。</p><

73、p>　　4.3.1 連續(xù)滅菌</p><p>　　連續(xù)滅菌是將培養(yǎng)基通過專門設(shè)計(jì)的滅菌器進(jìn)行連續(xù)流動(dòng)滅菌后，進(jìn)入預(yù)先滅過菌的發(fā)酵罐中的滅菌方式，工廠里也稱連消。</p><p>　　連續(xù)滅菌的加熱、保溫和冷卻3 個(gè)階段分別在不同的專有設(shè)備中進(jìn)行。由于培養(yǎng)基能在短時(shí)間內(nèi)被加熱到保溫溫度，并能很快被冷卻，因此可在比分批滅菌更高的溫度下滅菌。滅菌時(shí)間縮短，有利于減少營養(yǎng)物質(zhì)的破壞。連續(xù)滅菌

74、所用蒸汽壓力一般高于5 ×105 Pa (表壓) 。</p><p>　　連續(xù)滅菌采用高溫快速滅菌法，對培養(yǎng)基破壞小，且組成培養(yǎng)基的不同成分（耐熱與不耐熱，糖與氮源）可在不同溫度分開滅菌，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制，提高發(fā)酵罐的設(shè)備利用率，蒸汽用量平衡，節(jié)省冷卻水，但其對加熱蒸汽的壓力要求高，一般不小于0.45MPa，同時(shí)，連續(xù)滅菌需要一組附屬設(shè)備，設(shè)備投資大，蒸汽用量大。</p><p>

75、　　4.3.2 分批滅菌</p><p>　　分批滅菌是將配置好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐中，用飽和蒸汽加熱，使培養(yǎng)基和設(shè)備同時(shí)滅菌的一種滅菌方式，工廠里稱實(shí)消。</p><p>　　分批滅菌也稱實(shí)罐滅菌,全過程包括升溫、保溫、降溫3 個(gè)階段，這3 個(gè)階段分別對孢子的殺滅和培養(yǎng)基有效成分的破壞做出不同的貢獻(xiàn)。滅菌主要在保溫過程實(shí)現(xiàn)，但升溫的后期和冷卻的初期培養(yǎng)基的溫度高，因而也有一定的滅菌效果。&

76、lt;/p><p>　　分批滅菌無需專門的滅菌設(shè)備，設(shè)備投資少，滅菌效果可靠，對滅菌用蒸汽要求低（0.2～0.3MPa表壓），蒸汽利用率高，節(jié)約勞動(dòng)力，但因其滅菌溫度低，時(shí)間長對培養(yǎng)基成分破壞大，罐的利用率低，其操作要求難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制。</p><p>　　綜上所述，由于本設(shè)計(jì)采用分批流加L-山梨糖的方式發(fā)酵，且年產(chǎn)量較大，故本設(shè)計(jì)采用連續(xù)滅菌方式對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。</p>&

77、lt;p>　　4.4 空、實(shí)罐滅菌，連消滅菌及管道滅菌的具體操作</p><p>　　發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，對于內(nèi)部的邊邊角角不容易消毒，一般的發(fā)酵罐有自動(dòng)清洗裝置，清洗完之后徹底滅菌。為保證整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)無菌,從管道通入蒸汽,使罐內(nèi)蒸汽壓力達(dá)0.147MPa,維持45分鐘,滅菌過程從有關(guān)閥門、邊閥排出空氣,并使蒸汽通過達(dá)到死角滅菌。滅菌完畢，關(guān)閉蒸汽后，待罐內(nèi)壓力低于空氣過濾器壓力時(shí)，通入無菌空氣保壓0.0

78、98MPa。</p><p><b>　　a)空罐滅菌</b></p><p>　　空罐滅菌（空消）即發(fā)酵罐罐體的滅菌?？障麜r(shí)一般維持罐壓0.15～0.2Mpa，罐溫125～130℃，保持30～45min；要求總蒸汽壓力不低于0.3～0.35Mpa，使用汽壓不低于0.25～0.3MPa。</p><p><b>　　空罐消毒的操作是:

79、</b></p><p>　　( 1) 滅菌前, 用清水沖去罐內(nèi)泡沫等剩余料液( 升溫殺菌后放去) , 洗罐畢, 緊固料孔, 用棉花團(tuán)塞好視孔玻璃, 以防高溫時(shí)破裂;</p><p>　　( 2) 打開排氣口和各路管道, 以保證升溫時(shí)充分排氣, 防止死角;</p><p>　　( 3) 通入蒸汽, 在0.2 兆帕( 2kg/cm2) 表壓下, 保持30m

80、in, 遇有雜菌感染時(shí)應(yīng)適當(dāng)延長;</p><p>　　( 4) 空罐滅菌的同時(shí), 要進(jìn)行尿素、消泡劑和接種等有關(guān)管道的滅菌, 并進(jìn)行空氣保壓。</p><p><b>　　b)實(shí)罐滅菌</b></p><p>　　實(shí)罐滅菌（實(shí)消）是在培養(yǎng)基滅菌之前，通常應(yīng)先將與罐相連的分空氣過濾器用蒸汽滅菌并用空氣吹干。在引入無菌空氣前，應(yīng)注意罐壓必須低于過

81、濾器壓力，否則物料將倒流入過濾器內(nèi)，后果嚴(yán)重！滅菌時(shí)，總蒸汽管道壓力要求不低于0.3～0.35Mpa，使用壓力不低于0.2Mpa。</p><p>　　實(shí)罐滅菌時(shí)的操作是：</p><p>　　1）先將輸料管路內(nèi)的污水放掉沖凈，然后將配制好的培養(yǎng)基泵送至發(fā)酵罐（種子罐或料罐）內(nèi)，同時(shí)開動(dòng)攪拌器進(jìn)行滅菌。</p><p>　　2）滅菌前先將各排氣閥打開，將蒸汽引入夾套

82、或蛇管進(jìn)行預(yù)熱，待罐溫升至80～90℃，將排氣閥逐漸關(guān)小。</p><p>　　3）接著將蒸汽從進(jìn)氣口、排料口、取樣口直接通入罐中（如有沖視罐也同時(shí)進(jìn)汽），使罐溫上升到118～120℃，罐壓維持在0.09～0.1Mpa（表壓），并保持30min左右。各路進(jìn)氣要暢通，防止短路逆流，罐內(nèi)液體翻動(dòng)要激烈；各路排汽也要暢通，但排汽量不宜過大，以節(jié)約用氣量。</p><p>　　4）在保溫階段，凡進(jìn)

83、口在培養(yǎng)基液面以下的各管道及沖視鏡管都應(yīng)進(jìn)汽；凡開口在液面之上者均應(yīng)排汽。無論與罐連通的管路如何配制，在實(shí)消時(shí)均應(yīng)遵循“不進(jìn)則出”的原則。這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。</p><p>　　5）保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門，待罐內(nèi)壓力低于空氣壓力后，向罐內(nèi)通入無菌空氣，在夾套或蛇管中通冷卻水降溫，使培養(yǎng)基的溫度降到所需的溫度，進(jìn)行下一步的發(fā)酵和培養(yǎng)。 </p><p><b

84、>　　c)連續(xù)滅菌</b></p><p>　　連續(xù)滅菌（連消）：將配好的培養(yǎng)基連續(xù)加熱升溫、保溫滅菌和冷卻降溫。 </p><p><b>　　其特點(diǎn)是：</b></p><p>　?。?） 提高產(chǎn)量，設(shè)備利用率高。</p><p>　?。?）培養(yǎng)基受熱時(shí)間較短，所含營養(yǎng)成分破壞較少。</p&g

85、t;<p>　　（3）蒸汽負(fù)荷均衡，操作方便。</p><p>　?。?）降低了勞動(dòng)強(qiáng)度，適宜自動(dòng)控制。需要專門設(shè)備，投資較大，設(shè)備多染菌機(jī)會(huì)也相應(yīng)較多 。 </p><p><b>　　要求是：</b></p><p>　　培養(yǎng)基受熱時(shí)間要短，營養(yǎng)成分的損失要少；熱效率要高，能量消耗要少。</p><p>

86、;　?、?加熱設(shè)備：短時(shí)間內(nèi)加熱均勻一致，達(dá)到滅菌溫度；</p><p>　?、?維持設(shè)備：使培養(yǎng)基按順序流動(dòng)，維持滅菌溫度達(dá)到滅菌時(shí)間；</p><p>　?、?冷卻設(shè)備：密封性好，快速冷卻到發(fā)酵要求溫度，傳熱速率高，回收熱能。</p><p>　　工藝流程如下（圖3）：</p><p>　　圖3 連消-噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程</p&g

87、t;<p>　　配好的培養(yǎng)基用泵打入連消塔與蒸汽直接混合，達(dá)到滅菌溫度后進(jìn)入維持罐，維持一定時(shí)間后經(jīng)噴淋冷卻器冷卻至一定溫度后進(jìn)入發(fā)酵罐。</p><p>　　4.5 無菌空氣制備</p><p>　　在發(fā)酵過程中,微生物的生長和繁殖需要大量的氧氣,這就需要輸入大量的空氣來提供氧氣?？諝庵械奈⑸锒酁榧?xì)菌、細(xì)菌孢子,也有真菌、酵母和病毒,其大小從幾微米到幾百微米不等,小的微生

88、物附在空氣中的灰塵上,灰塵的平均尺寸約為011μm。粗濾器可將粗的微粒除去,015～210μm 的微粒及細(xì)菌微生物由空氣過濾器除去。</p><p><b>　　空氣除菌方法：</b></p><p>　　(1) 加熱滅菌。利用空氣被壓縮時(shí)所產(chǎn)生的熱來滅菌,為了保證壓縮后的空氣具有較高的溫度,將壓縮空氣出口管包裹保溫層。在單級絕熱壓縮機(jī) (29412 kPa) 運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)

89、,吸進(jìn)的空氣溫度為20 或27 ℃時(shí),壓縮后出口空氣的溫度分別上升到150 或270 ℃。這種滅菌方法必須保證有足夠的滅菌時(shí)間,為了徹底除菌,必須在罐前安裝1 個(gè)空氣過濾器。</p><p>　　(2) 輻射滅菌。波長22615～32817 nm 的紫外線對空氣中微生物的殺菌效力最強(qiáng),但設(shè)備投資高,在發(fā)酵工業(yè)中還很少應(yīng)用。</p><p>　　(3) 化學(xué)滅菌。使空氣在殺菌劑溶液中通過或?qū)?/p>

90、殺菌劑溶液噴灑于空氣中的微生物上,但必須除去帶殺菌劑的水氣和霧后才能應(yīng)用。</p><p>　　(4) 靜電除塵。靜電除塵的特點(diǎn)是能量消耗少,空氣的壓頭損失小,為400～2 000 Pa ;對1μm 的塵粒捕集效率可達(dá)99 %以上,缺點(diǎn)是設(shè)備龐大。</p><p>　　(5) 介質(zhì)過濾。發(fā)酵工業(yè)制備無菌空氣廣泛采用纖維過濾器。</p><p>　　比較理想的空氣除菌

91、流程應(yīng)具備以下特點(diǎn):①高空采風(fēng),吸氣風(fēng)管設(shè)置在工廠上方高為20～30m處,減少吸入空氣的細(xì)菌含量; ②在空壓機(jī)空氣入口處安裝中效或高效前置過濾器,以減輕總過濾器的負(fù)荷; ③采用無油潤滑壓縮機(jī),減少壓縮后空氣中的油霧污染; ④壓縮機(jī)后部采用冷卻型的空氣儲(chǔ)罐,可降低空氣的溫度,同時(shí)除去部分潤滑油; ⑤采用二級冷卻二級旋風(fēng)分離器,使油水分離較完全; ⑥采用旋風(fēng)金屬網(wǎng)除霧器,除去空氣中的霧滴; ⑦用蒸汽加熱器將空氣加熱至約50 ℃,使空氣的相對

92、濕度低于60 % ,再進(jìn)入總過濾器,以保證總過濾器保持干燥狀態(tài); ⑧空氣經(jīng)總過濾器進(jìn)入分過濾器,再進(jìn)入發(fā)酵罐,空氣的除菌程度達(dá)到99.999 %。</p><p>　　下圖（圖4）是一個(gè)典型的除菌流程,在本設(shè)計(jì)中基本上采用該流程。</p><p>　　圖4 兩級冷卻、加熱除菌加熱流程</p><p>　　流程：將壓縮空氣冷卻到30～35℃、相對濕度為60%～70%以

93、下。</p><p>　　首先粗過濾器捕集空氣中較大的灰塵顆粒，起到保護(hù)空氣壓縮機(jī)，防止其受磨損的作用。同時(shí)也可減輕空氣過濾的負(fù)擔(dān)。然后空氣進(jìn)入壓縮機(jī)壓縮后到達(dá)貯罐，貯罐的作用是消除壓縮機(jī)排除空氣量的脈沖，維持穩(wěn)定的空氣壓力，同時(shí)也可以利用重力沉降作用分離部分油霧?？諝庠俳?jīng)冷卻后，進(jìn)入旋風(fēng)分離器將空氣中被冷凝成霧狀的水霧和油霧除去。經(jīng)第二個(gè)冷卻器使空氣進(jìn)一步冷卻，析出較小的霧粒，再經(jīng)具有較高分離效率的絲網(wǎng)分離器，

94、除去較細(xì)小的霧狀微粒。適當(dāng)加熱后，最后經(jīng)過濾器完成空氣的過濾除菌操作。</p><p>　　特點(diǎn)：流程最簡單，所用設(shè)備最少適用于北方和內(nèi)陸氣候干燥地區(qū)。</p><p><b>　　4.6 發(fā)酵方式</b></p><p>　　發(fā)酵方式有分批、連續(xù)、半連續(xù)和分批-補(bǔ)料四種。</p><p>　　分批發(fā)酵在工業(yè)生產(chǎn)上仍有重

95、要地位.采用分批作業(yè)有技術(shù)和生物上的理由,即操作簡單，周期短，染菌的機(jī)會(huì)減少和生產(chǎn)過程、產(chǎn)品質(zhì)量易掌握。但是分批發(fā)酵不適用于測定其過程動(dòng)力學(xué),因使用復(fù)合培養(yǎng)基,不能簡單地運(yùn)用Monod方程來描述生長,存在基質(zhì)抑制問題,出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象。如對基質(zhì)濃度敏感的產(chǎn)物，或者次級代謝物，抗生素，用分批發(fā)酵不合適，因其周期短，一般在1-3天，產(chǎn)率較低，這是由于養(yǎng)分的耗竭，無法維持下去。</p><p>　　連續(xù)發(fā)酵方式易染菌，

96、產(chǎn)物濃度低，菌種易退化，效率低，工業(yè)上一般不采用。</p><p>　　半連續(xù)發(fā)酵方式技術(shù)上受限制；發(fā)酵液被稀釋后可能產(chǎn)生更多的代謝有害物，最終限制發(fā)酵產(chǎn)物的合成；一些經(jīng)代謝產(chǎn)生的前體可能丟失；有利于非產(chǎn)生菌突變株的生長；而且效率比較低。</p><p>　　分批-補(bǔ)料發(fā)酵方式與分批發(fā)酵方式相比可解除營養(yǎng)物質(zhì)抑制、產(chǎn)物反饋抑制和分解產(chǎn)物的阻遏作用，通過補(bǔ)稀料，可降低發(fā)酵液的黏度，提高傳氧速

97、率，可使發(fā)酵系統(tǒng)處于準(zhǔn)穩(wěn)定狀態(tài)，且重復(fù)進(jìn)行，便于理論研究；與連續(xù)發(fā)酵方式相比，發(fā)酵時(shí)間短，不存在染菌難題，不造成菌種老化和變異，最終產(chǎn)物濃度高，有利用產(chǎn)物的分離，隨著菌體生長消耗快，需要中間補(bǔ)料，工業(yè)上廣泛采用。而且，分批-補(bǔ)料發(fā)酵還能在一種系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度，從而避免快速利用氮源的阻遏效應(yīng)和能夠按設(shè)備的通氣能力去維持適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件，并且能減緩代謝有害物的不利影響。</p><p>　　根據(jù)以上論證，本設(shè)計(jì)

98、采用分批-補(bǔ)料的發(fā)酵方式。</p><p><b>　　4.7 發(fā)酵罐</b></p><p>　　本設(shè)計(jì)采用氣升式發(fā)酵罐。氣升式發(fā)酵罐是上世紀(jì)末開始發(fā)展應(yīng)用的一種新型生物反應(yīng)器，無機(jī)械攪拌機(jī)構(gòu)最大限度的減少了染菌率，減少了機(jī)械剪切力，對長菌絲的各種真菌尤為適宜，氣體提升充分的氣液混合使氧氣的傳遞利用極大提高，特別適合高粘度培養(yǎng)基和對于溶氧要求高的產(chǎn)品。氣升罐可根據(jù)用

99、戶要求設(shè)計(jì)內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)兩種，也可以衍生設(shè)計(jì)制造光照生物反應(yīng)器，廣泛應(yīng)用于光合細(xì)菌、藻類的培養(yǎng)。</p><p><b>　　4.8 古龍酸發(fā)酵</b></p><p>　　4.8.1 一步發(fā)酵菌種液的制備</p><p>　　無菌條件下,用接種環(huán)挑取斜面菌苔一環(huán)，接入三角瓶種液培養(yǎng)基中,將菌苔打散，于35℃靜止培養(yǎng)60h, 鏡檢菌體正常，無雜

100、菌，可進(jìn)行下一步操作。</p><p>　　4.8.2 一步一級種子的培養(yǎng)</p><p>　　在pH5.4、120℃保溫30min滅菌，待罐溫冷卻至30～34℃，將菌種液接入已滅菌冷卻的種子培養(yǎng)基中，通入無菌空氣(1vvm)，維持罐壓0.03～0.05MPa，條件下培養(yǎng)20h。</p><p>　　4.8.3一步二級種子的培養(yǎng)</p><p&g

101、t;　　在pH5.4、120℃保溫30min滅菌，待罐溫冷卻至30～34℃，將一步一級種子接入已滅菌冷卻的種子培養(yǎng)基中，通入無菌空氣(1vvm)，維持罐壓0.03～0.05MPa，條件下培養(yǎng)20h。</p><p>　　4.8.4 一步發(fā)酵</p><p>　　在pH5.4～5.6，蒸汽滅菌冷卻后，按接種量為10％接入二級種子培養(yǎng)液。在31～34℃，通入無菌空氣(0.7vvm)，發(fā)酵罐壓0

102、.03～0.05MPa條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)酵率≥95％，pH值在7.2左右，糖量不再上升時(shí)即為發(fā)酵終點(diǎn)。約為25小時(shí)。</p><p>　　發(fā)酵結(jié)束后對山梨糖醪液80℃加熱10min，冷卻至30℃，再開始進(jìn)行第二步混合菌株發(fā)酵。</p><p>　　4.8.5 一步發(fā)酵的影響因素</p><p>　?、傺趸俾逝c山梨醇的濃度有很大關(guān)系。濃度≥25％，形成底物抑制；≥

103、40％，通氣速率低，細(xì)菌幾乎無作用，但濃度過低，則需龐大的發(fā)酵罐及濃縮設(shè)備，設(shè)備利用率低，選用濃度一般不大于25％。</p><p>　?、诎l(fā)酵液中加生物催化劑(如維生素B族、玉米漿、酵母)能提高發(fā)酵率。</p><p>　　③發(fā)酵液中金屬離子的存在抑制細(xì)菌脫氫活性，鎳離子抑制作用最強(qiáng)。因而控制山梨醇中鎳≤5mg/kg，鐵≤70mg/kg。</p><p>　?、芸?/p>

104、氣流量(vvm)越大越有利于發(fā)酵，但過大，動(dòng)力消耗大，且泡沫量增大，一般生產(chǎn)上控制在0.7～1.0vvm。</p><p>　　4.8.6 二步發(fā)酵混合菌種液的制備</p><p>　　冷凍管的大、小菌種活化，分離及混合培養(yǎng)后移入三角瓶種液培養(yǎng)基中，在29～33℃振蕩培養(yǎng)24h，當(dāng)產(chǎn)酸量在6～9 mg/m1，pH值降至7以下，菌形正常無雜菌，即可接入種子罐。</p><

105、p>　　4.8.7 二步一級種子的培養(yǎng)</p><p>　　一級種子罐內(nèi)加入滅菌培養(yǎng)基，控制溫度30℃，以10%(V/ V) 接種量接種到種子罐培養(yǎng)基中，通入無菌空氣，維持罐壓為0.05MPa，pH6.7～7.0，至產(chǎn)酸量達(dá)合格濃度，且不再增加時(shí)，即可接入二級種子罐培養(yǎng)。 </p><p>　　4.8.8 二步二級種子的培養(yǎng)</p><p>　　二級種子罐內(nèi)

106、加入滅菌培養(yǎng)基，控制溫度30℃，以10%(V/ V) 接種量接種到種子罐培養(yǎng)基中，通入無菌空氣，維持罐壓為0.05MPa，pH6.7～7.0，種子液產(chǎn)酸量達(dá)到10 - 14mg/mL 后接入二步三級發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。</p><p>　　4.8.9 二步發(fā)酵</p><p>　　發(fā)酵培養(yǎng)基含有8% (W /V)的L - 山梨糖,接種量為10%。在整個(gè)發(fā)酵過程中, 溶氧控制在30%左右,

107、溫度為29 ±1℃,自動(dòng)控制流加Na2CO3堿溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為6. 5～6. 7,在發(fā)酵過程中每隔4h取樣,鏡檢并測其殘?zhí)羌? - 酮基- L - 古龍酸含量。當(dāng)殘?zhí)墙抵?. 42%以下時(shí),發(fā)酵結(jié)束。</p><p>　　4.8.10 影響二步發(fā)酵產(chǎn)率的主要因素</p><p><b>　?、偕嚼嫣浅跏紳舛?</b></p><p&g