水稻抗褐飛虱基因bph14的分離和功能分析-生物學(xué)、遺傳學(xué)

1、<p><b>　　中文摘要</b></p><p>　　褐飛虱（Nilaparvata lugens Stål.，BPH）是水稻種植地區(qū)為害水稻最嚴(yán)重的害蟲之一。褐飛虱為害水稻程度較輕時，導(dǎo)致水稻植株矮小、生長活力降低、分蘗減少和產(chǎn)量下降；而褐飛虱為害水稻嚴(yán)重時，將導(dǎo)致植株整體死亡。由于目前種植的水稻大部分都是感褐飛虱品種，農(nóng)民只能使用農(nóng)藥來防治褐飛虱。但是農(nóng)藥的使用增

2、加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成本，并造成環(huán)境的污染。因此，最經(jīng)濟的、對環(huán)境最友好的防治褐飛虱的方法是種植抗褐飛虱的水稻品種。迄今為止，科學(xué)家已經(jīng)在栽培稻和野生稻中定位了21個抗褐飛虱基因，但并沒有一個抗褐飛虱基因被克隆出來，并且水稻抗褐飛虱的分子機制也不清楚。</p><p>　　在早期研究中，我們在水稻品種B5中定位了兩個抗褐飛虱基因Bph14和Bph15。其中，Bph14基因位于水稻第三染色體長臂，Bph15基因位于水稻第

3、四染色體短臂。為了克隆Bph14基因，我們從B5與明恢63的重組自交系中選擇了抗性品種RI35，它只含有抗褐飛虱基因Bph14。我們用RI35和感褐飛虱水稻品種臺中本地1號（TN1）雜交，得到的F1代再自交，從而構(gòu)建了F2作圖群體。我們隨機選擇了100株F2植株進行抗蟲鑒定，結(jié)果顯示抗性和感性植株的分離比為3：1（72:28；χ2=0.48），這表明在RI35中單個的Bph14基因提供了水稻對褐飛虱的抗性。</p><

4、;p>　　為了定位Bph14基因，我們用側(cè)翼分子標(biāo)記RM514和SM4篩選了3700份F2植株，得到了49株重組單株。我們分析了這些重組單株的基因型和表型，將Bph14基因定位于分子標(biāo)記RM570和G1318之間120kb的區(qū)段。為了進一步精細(xì)定位Bph14基因，我們從F2植株中選取Bph14區(qū)域為雜合，而其他區(qū)域來源于TN1的單株。這些單株自交后再選擇，一直到F5代群體。我們用5000份的F5植株來構(gòu)建高密度的定位圖譜，并最終將

5、Bph14定位在標(biāo)記SM1和G1318之間34kb的區(qū)段。該區(qū)段測序后，我們發(fā)現(xiàn)有兩個預(yù)測的編碼抗性蛋白的基因，分別命名為Ra和Rb。為了最終確定哪個基因是Bph14基因，我們將預(yù)測的Ra和Rb基因以及攜帶自身啟動子的轉(zhuǎn)化載體，分別轉(zhuǎn)入感褐飛虱水稻品種Kasalath。然后，我們對轉(zhuǎn)基因的T2代做了抗蟲鑒定。鑒定結(jié)果表明：所有表達Ra基因的轉(zhuǎn)基因T2代植株均為對褐飛虱的抗性，而Rb的轉(zhuǎn)基因T2代植株仍是感蟲的。另外，我們利用RNAi技術(shù)

6、抑制了抗蟲品種RI35的Ra基因的表達，對RNAi轉(zhuǎn)基因T2代植株的抗蟲鑒定結(jié)果表明Ra基因被抑制的植株喪失了對褐飛虱的抗性。因此，我們</p><p>　　Bph14基因編碼一個1,323氨基酸的蛋白質(zhì)，其具有一個螺旋-螺旋（Coiled-coil，CC），核結(jié)合位點（Nucleotide-binding，NB）和亮氨酸富集重復(fù)（Leucine-rich，LRR）的基序。進化樹分析表明，Bph14蛋白與水稻中的

7、其他抗病蛋白的關(guān)系較近，而與其他植物已知的抗病蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。我們分析了在21個水稻品種的Bph14等位基因的表達。這些品種中，Bph14的等位基因均有轉(zhuǎn)錄，且表達量在大部分品種中都沒有差異。但是，通過序列比較，我們發(fā)現(xiàn)Bph14蛋白的CC和NB區(qū)的功能基序在這些水稻品種中是保守的，不同水稻品種之間沒有差異，而LRR區(qū)則存在54個獨有的氨基酸以及兩個氨基酸的缺失。</p><p>　　Bph14基因在水稻根、葉

8、鞘和葉片中組成型表達，且表達量隨褐飛虱取食時間而增強。為了檢測Bph14基因的表達部位，我們構(gòu)建了Bph14基因的啟動子驅(qū)動GUS基因的轉(zhuǎn)化載體，并轉(zhuǎn)入水稻Kasalath。我發(fā)現(xiàn)Bph14基因主要在根、葉鞘和葉片的導(dǎo)管和篩管周圍的薄壁細(xì)胞表達。我們將Bph14基因與綠色熒光蛋白融合，并在洋蔥表皮細(xì)胞瞬時表達。我們發(fā)現(xiàn)Bph14蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中。</p><p>　　為了研究Bph14轉(zhuǎn)基因植株的抗性機制，我們

9、觀察了在抗性的Bph14轉(zhuǎn)基因植株以及感性的野生型植株中，褐飛虱的不同表現(xiàn)。這些研究包括褐飛虱對宿主的選擇，褐飛虱的取食行為、蜜露量、群體生長率、存活率以及產(chǎn)卵力。在宿主選擇性實驗中，我們觀察到分布在轉(zhuǎn)基因和野生型植株上的褐飛虱沒有顯著性差異。褐飛虱在不同的抗、感植株上的產(chǎn)卵數(shù)目也沒有太大差異。我們用電子刺探儀記錄了褐飛虱在水稻上的取食行為。數(shù)據(jù)結(jié)果表面，當(dāng)褐飛虱取食Bph14轉(zhuǎn)基因以及野生型植株時，褐飛虱第一次穿刺到達韌皮部的時間，以

10、及第一次在韌皮部的消化時間并沒有差異。而在取食Bph14轉(zhuǎn)基因植株時，褐飛虱的非刺探時間以及穿刺時間有明顯增加，并且在韌皮部的消化時間顯著減少。與此相同的是，褐飛虱取食Bph14轉(zhuǎn)基因植株后，分泌的蜜露也明顯降低。同時，在Bph14轉(zhuǎn)基因植株中褐飛虱的群體生長率僅為在感性品種的1/5，并且褐飛虱在Bph14轉(zhuǎn)基因植株上的存活率也明顯比在野生型植株上低。這些結(jié)果表明Bph14基因介導(dǎo)的抗性是抗生性，能降低褐飛虱的取食，生長和存活率。<

11、;/p><p>　　我們觀察到，褐飛虱取食Bph14轉(zhuǎn)基因植株后，Bph14轉(zhuǎn)基因植株的篩板以及維管組織的細(xì)胞壁都有大量胼胝質(zhì)沉積的現(xiàn)象。我們調(diào)查了胼胝質(zhì)相關(guān)基因的表達模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在褐飛虱取食后的野生型和Bph14轉(zhuǎn)基因植株中，三種胼胝質(zhì)合成酶基因（GSL1、GSL5和GSL10）的表達量都有上調(diào)。然而，編碼胼胝質(zhì)水解酶（β-1, 3-葡聚糖酶）的基因（GNS5和GNS9）僅在Bph14轉(zhuǎn)基因植株的表達量下調(diào)。因

12、此，我們認(rèn)為褐飛虱取食后，主要是Bph14轉(zhuǎn)基因植株中胼胝質(zhì)水解酶基因表達的下調(diào)導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因植株中胼胝質(zhì)的沉積和篩管的堵塞。另外，我們發(fā)現(xiàn)褐飛虱取食轉(zhuǎn)基因植株后，轉(zhuǎn)基因植株的Bowman-Birk胰島素抑制劑基因的表達量上調(diào)更明顯，而褐飛虱體內(nèi)的胰島素基因則受到更多的抑制。這些結(jié)果表明，Bph14轉(zhuǎn)基因植株中胼胝質(zhì)的沉積以及胰島素抑制劑產(chǎn)物阻止了褐飛虱的持續(xù)取食和韌皮部汁液的消化。</p><p>　　植物防御昆

13、蟲取食的信號途徑包括激活水楊酸和茉莉酸/乙烯信號分子。我們檢測了褐飛虱取食后，水楊酸和茉莉酸/乙烯信號途徑基因在Bph14轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的表達量。在轉(zhuǎn)基因植株中，茉莉酸/乙烯信號途徑基因（LOX、AOS2和EIN2）的表達比野生型明顯降低，而水楊酸信號途徑基因（EDS1，PAD4，ICS1，PAL和NPR1）的表達比野生型有明顯上升。這些結(jié)果表明褐飛虱取食后，Bph14基因可能激活了水楊酸依賴的抗性途徑。PR基因被認(rèn)為在植物中能

14、有效抑制病原菌生長并阻止其擴散，使植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。在Bph14轉(zhuǎn)基因植株中，PR基因（PR1b，PR4，PR5和PR10）的表達量明顯比野生型低。因此，褐飛虱取食后，Bph14激活的是一個不依賴于PR基因的抗性途徑。</p><p>　　Bph14基因是第一個成功克隆的水稻抗褐飛虱基因。它的研究為水稻抗褐飛虱的分子機制奠定了基礎(chǔ)。在Bph14基因介導(dǎo)的水稻對褐飛虱的抗性機制中，早期宿主/昆蟲識別，胼胝質(zhì)沉

15、積，胰島素抑制劑產(chǎn)生以及植物激活水楊酸防御信號途徑的機制與植物的抗病機制具有很大的相似性。Bph14的克隆能推動水稻抗蟲基因的研究，為培育抗蟲水稻打下基礎(chǔ)。Bph14的克隆有效控制褐飛虱，并減少了農(nóng)藥的使用，降低了生產(chǎn)成本和環(huán)境的污染。</p><p>　　關(guān)鍵詞：褐飛虱，Bph14，圖位克隆，CC-NB-LRR蛋白，抗生性，信號途徑</p><p>　　Isolation and fun

16、ctional analysis of a brown planthopper resistance gene Bph14 in rice</p><p>　　Doctoral Candidate: Du Bo</p><p>　　Supervisor: Prof. He Guangcun</p><p>　　(College of

17、 Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072)</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　The brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål, BPH) is one of the most destructive pests in cr

18、op production worldwide. Light planthopper infestation reduces plant height, growth vigor and the number of productive tillers, while heavy infestation cause complete drying of the crop. As the popular rice varieties are

19、 susceptible to planthoppers, farmers depend solely on chemical pesticides to control this insect, which is expensive in terms of labor, cost and environment. The most economical and en</p><p>　　Previously,

20、we mapped two major BPH-resistance genes in rice B5, Bph14 on the long arm of chromosome 3 and Bph15 on the shorter arm of chromosome 4. To identify the Bph14 gene, we developed an F2 mapping population derived from a cr

21、oss between RI35, a recombinant inbred line containing the Bph14 locus from B5, and Taichuang Native 1 (TN1), a BPH-susceptible indica variety.The resistant and susceptible plants segregated in a 3:1 ratio (72:28; χ2=0.4

22、8) in the F2 population, indicating that a singl</p><p>　　To identify the Bph14 gene, we used the flanking markers RM514 and SM4 to screen 3,700 F2 plants and obtained 49 recombinants. We analyzed the genoty

23、pe and biotype of these recombinants and located the Bph14 gene in a 120-kb region between the markers RM570and G1318. For further fine mapping, we selected the F2 plants in which the region around Bph14 was heterozygous

24、 and other regions were derived from TN1. These plants were self-pollinated and selected until the F5 generation. The F5 population</p><p>　　The Bph14 gene encodes a putative 1,323 amino acid protein contain

25、ing a coiled-coil, nucleotide-binding and leucine-rich repeat (CC-NB-LRR) motif. Phylogenetic analysis revealed that Bph14 is closely related to other rice disease resistance proteins and is divergent from the majority o

26、f known plant disease resistance proteins in other species. We analyzed the expression of the Bph14 alleles for 21 rice varieties. The results showed that the transcripts were present in all of the rice varieties a</p

27、><p>　　The Bph14 gene was expressed constitutively in leaf sheaths, leaf blades and roots and was enhanced by BPH feeding. Then we examined Bph14 activity using transgenic plants carrying the fusion constructs

28、of the Bph14 promoter region and the GUS reporter gene and we found that Bph14 was expressed mainly in the parenchyma cells bordering xylem vessels and sieve tubes of various organs, including leaf sheaths and leaf blade

29、s. By translation a Bph14 and green fluorescent protein (GFP) fusion construc</p><p>　　To explore the resistance mechanism of the Bph14-transgenic plants, we investigated the responses of the BPH insects fee

30、ding on the resistant Bph14-transgenic and susceptible wild-type plants in terms of host choice, feeding activities, honeydew excretion, population growth rate, nymph survival and fecundity. In host choice tests, there w

31、as no significant difference in numbers of BPH nymphs that settled on the plants between the transgenics and wild-type. Neither was it different in number of eg</p><p>　　We observed that callose was deposite

32、d abundantly on sieve plates and the cell walls of vascular tissue in the Bph14-transgenic plants after BPH infestation. Then we examined the expression patterns of callose-related genes. Three callose synthase-encoding

33、genes, GSL1, GSL5 and GSL10, were clearly up-regulated in both the wild-type and transgenic rice plants after BPH infestation. However, the expression of the genes, GNS5 and GSN9, encoding callose-hydrolyzing enzyme β-1,

34、 3-glucanase, was sligh</p><p>　　Plant defense responses to insects include the activation of pathways dependent on SA (salicylic acid) and JA (jasmonic acid) / ethylene signaling molecules. We examined tran

35、script levels of defense-responsive genes involving in SA- and JA/ethylene-dependent pathways. The transcript levels of the genes, LOX, AOS2 and EIN2, involving in the JA/ethylene- dependent pathway were substantially lo

36、wer in the transgenics. However, transcript levels of the genes, EDS1, PAD4, ICS1, PAL and NPR1, involving</p><p>　　To our knowledge, this is the first report of a BPH-resistance gene, Bph14, in rice. Our re

37、sults provide evidence of the molecular mechanism of rice resistance to the BPH. In the Bph14-mediated resistance of rice against the BPH, early host/insect recognition, callose deposition, trypsin inhibitor production a

38、nd the activation of plant defenses through the SA signal transduction pathway are fundamentally similar to defense mechanisms against pathogens. The identification of the Bph14 gene should</p><p>　　Key word

39、: Brown planthopper, Bph14, Map-based cloning, CC-NB-LRR protein, Antibiosis, SA signaling pathway</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　中文摘要I</b></p><p>　　Abs

40、tractIV</p><p>　　第一章 前 言1</p><p>　　1. 褐飛虱研究概況1</p><p>　　1.1 褐飛虱的形態(tài)特征及其生活史1</p><p>　　1.2 褐飛虱的生物型1</p><p>　　1.3 褐飛虱的取食行為及其對水稻的為害3</p><p&g

41、t;　　1.4水稻抗褐飛虱資源的挖掘和抗褐飛虱基因的研究3</p><p>　　2. 植物對昆蟲抗性研究進展6</p><p>　　2.1 植物對昆蟲的直接防御7</p><p>　　2.1.1 植物中具有抗蟲作用的抑制劑8</p><p>　　2.1.2 植物中具有抗蟲作用的次生化合物9</p><p>　

42、　2.2 植物對昆蟲的間接防御作用10</p><p>　　2.2.1 昆蟲取食誘導(dǎo)的揮發(fā)性化合物10</p><p>　　2.2.2 昆蟲的特異性引發(fā)子11</p><p>　　2.3 植物抗蟲反應(yīng)中的信號傳導(dǎo)途徑11</p><p>　　2.3.1刺吸式昆蟲引起的信號途徑12</p><p>　　2.3.

43、2咀嚼式昆蟲引起的信號途徑13</p><p>　　2.4 植物抗性的遺傳基礎(chǔ)14</p><p>　　2.4.1 基因?qū)蚣僬f（Gene-for-Gene Hypothesis）15</p><p>　　2.4.2 保衛(wèi)假說（Guard Hypothesis）16</p><p>　　2.4.3 植物先天免疫系統(tǒng)簡介18<

44、/p><p>　　2.4.4 已經(jīng)克隆的植物抗性基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點19</p><p>　　3. 圖位克隆法21</p><p>　　3.1 分子標(biāo)記遺傳連鎖圖24</p><p>　　3.2 目的基因的精細(xì)定位24</p><p>　　3.3 構(gòu)建包含目的區(qū)段的重疊群25</p><p&

45、gt;　　3.4 確定候選基因26</p><p>　　3.5 功能互補試驗26</p><p>　　4. 研究的目的和意義27</p><p>　　第二章 Bph14的精細(xì)定位29</p><p>　　1. 材料和方法29</p><p><b>　　1.1 材料29</b><

46、/p><p>　　1.2 RI35和RI113遺傳背景的分析30</p><p>　　1.3 以TN1/RI35的F2群體驗證Bph14初步定位結(jié)果30</p><p>　　1.4 以TN1/RI35的F2群體以及F5群體精細(xì)定位Bph1432</p><p>　　1.5 Bph14區(qū)段物理圖譜的構(gòu)建33</p><p

47、>　　2. 結(jié)果與分析34</p><p>　　2.1 RI35和RI113遺傳背景的分析34</p><p>　　2.2 以TN1/RI35的F2群體驗證Bph14初步定位結(jié)果36</p><p>　　2.2.1 苗期集團法鑒定結(jié)果36</p><p>　　2.2.2 RI35的抗褐飛虱QTL掃描38</p>

48、<p>　　2.3 以TN1/RI35的F2群體以及F5群體精細(xì)定位Bph1439</p><p>　　2.4 Bph14區(qū)段物理圖譜的構(gòu)建40</p><p><b>　　3. 討論41</b></p><p>　　3.1 RI35和RI113遺傳背景的分析41</p><p>　　3.2 以TN1/

49、RI35的F2群體驗證Bph14初步定位結(jié)果42</p><p>　　3.3 以TN1/RI35的F2群體以及F5群體精細(xì)定位Bph1442</p><p>　　3.4 Bph14區(qū)段物理圖譜的構(gòu)建43</p><p>　　第三章 Bph14的功能驗證45</p><p>　　1. 材料和方法45</p><p&

50、gt;<b>　　1.1 材料45</b></p><p>　　1.2 Bph14區(qū)段的候選基因分析45</p><p>　　1.3 預(yù)測基因的表達分析46</p><p>　　1.3.1 水稻葉鞘總RNA的提取和檢測46</p><p>　　1.3.2 半定量RT-PCR47</p><p

51、>　　1.4 候選基因的篩選47</p><p>　　1.5 載體構(gòu)建48</p><p>　　1.5.1 基因表達載體的構(gòu)建48</p><p>　　1.5.2 超量表達載體的構(gòu)建49</p><p>　　1.4.3 RNAi載體的構(gòu)建49</p><p>　　1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化50&

52、lt;/p><p>　　1.5.1愈傷組織的誘導(dǎo)50</p><p>　　1.5.2 前培養(yǎng)50</p><p>　　1.5.3 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和懸浮50</p><p>　　1.5.4 感染和共培養(yǎng)51</p><p>　　1.5.5 農(nóng)桿菌的去除51</p><p>　　1.5.6 愈傷

53、組織的篩選51</p><p>　　1.5.7 分化與移栽51</p><p>　　1.5.8 轉(zhuǎn)基因植株的檢測52</p><p>　　2. 結(jié)果與分析52</p><p>　　2.1 Bph14區(qū)段的候選基因分析52</p><p>　　2.2預(yù)測基因的表達分析53</p><p&g

54、t;　　2.3候選基因Ra和Rb的篩選54</p><p>　　2.4 Ra和Rb的轉(zhuǎn)基因功能驗證55</p><p><b>　　3. 討論59</b></p><p>　　3.1 Bph14區(qū)段的候選基因分析59</p><p>　　3.2 Ra和Rb的轉(zhuǎn)基因功能驗證60</p><p&

55、gt;　　第四章 Bph14的結(jié)構(gòu)和表達分析62</p><p>　　1. 材料和方法62</p><p><b>　　1.1 材料62</b></p><p>　　1.2 基因及蛋白結(jié)構(gòu)分析62</p><p>　　1.3 Bph14的表達分析63</p><p>　　1.4 Bph1

56、4蛋白的亞細(xì)胞定位64</p><p>　　1.5 Bph14的組織化學(xué)定位65</p><p>　　2. 結(jié)果與分析66</p><p>　　2.1 Bph14蛋白的結(jié)構(gòu)66</p><p>　　2.2 Bph14與其等位基因的比較68</p><p>　　2.3 Bph14基因的表達和定位76</

57、p><p><b>　　3. 討論78</b></p><p>　　3.1 Bph14蛋白的結(jié)構(gòu)78</p><p>　　3.2 Bph14與其等位基因的比較78</p><p>　　3.3 Bph14基因的表達和定位79</p><p>　　第五章 Bph14介導(dǎo)的水稻抗性機制及信號途徑8

58、0</p><p>　　1. 材料和方法80</p><p><b>　　1.1 材料80</b></p><p>　　1.2 Bph14介導(dǎo)的抗性機制80</p><p>　　1.2.1 褐飛虱的宿主選擇性80</p><p>　　1.2.2 褐飛虱的產(chǎn)卵力80</p>

59、<p>　　1.2.3 電子刺吸儀（EPG）記錄褐飛虱的取食行為81</p><p>　　1.2.4 褐飛虱無選擇取食的蜜露量測量81</p><p>　　1.2.5褐飛虱的群體生長率82</p><p>　　1.2.6褐飛虱的存活率82</p><p>　　1.3 胼胝質(zhì)的染色觀察82</p><p&

60、gt;　　1.4 防御相關(guān)基因的表達分析83</p><p>　　2. 結(jié)果與分析84</p><p>　　2.1 Bph14介導(dǎo)的抗性機制84</p><p>　　2.1.1 褐飛虱的宿主選擇性84</p><p>　　2.1.2 褐飛虱的產(chǎn)卵力85</p><p>　　2.1.3 EPG記錄褐飛虱在水稻植

61、株上的取食行為86</p><p>　　2.1.4褐飛虱無選擇取食的蜜露量測量87</p><p>　　2.1.5褐飛虱的群體生長率88</p><p>　　2.1.6褐飛虱的存活率88</p><p>　　2.2 褐飛虱誘導(dǎo)的水稻葉鞘維管束胼胝質(zhì)的變化90</p><p>　　2.3 胼胝質(zhì)相關(guān)基因的表達

62、91</p><p>　　2.4 水稻中蛋白酶抑制子基因以及褐飛虱胰蛋白酶基因的表達93</p><p>　　2.5 Bph14對不同防御反應(yīng)信號途徑及病程相關(guān)基因表達的影響94</p><p>　　2.5.1 Bph14轉(zhuǎn)基因植株中防御信號途徑基因的表達分析94</p><p>　　2.5.2 Bph14轉(zhuǎn)基因植株中病程相關(guān)蛋白基因的

63、表達分析96</p><p><b>　　3．討論97</b></p><p>　　3.1 Bph14介導(dǎo)的抗性機制97</p><p>　　3.2 胼胝質(zhì)和蛋白酶抑制劑在水稻防御褐飛虱取食中的作用99</p><p>　　3.3 Bph14激活的防御反應(yīng)信號途徑和病程相關(guān)蛋白100</p>&l

64、t;p>　　第六章 總 討 論102</p><p>　　1. Bph14介導(dǎo)的抗褐飛虱機制與植物防御病原菌機制的相似性102</p><p>　　2. Bph14基因和Mi基因103</p><p>　　3. 抗褐飛虱基因和褐飛虱的生物型104</p><p>　　4. Bph14基因在水稻的抗蟲理論研究和育種實踐中的應(yīng)用

65、104</p><p><b>　　參考文獻106</b></p><p>　　附錄I 實驗室常用Protocol及所用溶液配方123</p><p>　　Protocol 1： PAGE膠操作流程及試劑123</p><p>　　Protocol 2：DNA的限制性消化，電泳與Southern轉(zhuǎn)移123<

66、;/p><p>　　Protocol 3：探針標(biāo)記124</p><p>　　Protocol 4：Southern 雜交124</p><p>　　Protocol 5：洗膜，壓片及膜的再生125</p><p>　　Protocol 6: 用于PCR的cDNA第一鏈的合成125</p><p>　　附錄II 博

67、士在讀期間發(fā)表的論文127</p><p><b>　　致謝128</b></p><p>　　第一章 前 言</p><p>　　1. 褐飛虱研究概況</p><p>　　1.1 褐飛虱的形態(tài)特征及其生活史</p><p>　　褐飛虱（Nilaparvata lugens St

68、9;l.，簡稱BPH）使同翅目飛虱科（Homoptera:Delphacidae）昆蟲，主要分布于東亞、東南亞、南亞次大陸、澳大利亞北部及南太平洋群島（Sōgawa, 1982）。褐飛虱的生命周期分為卵、若蟲、成蟲三個階段。褐飛虱的卵為香蕉形，前端尖細(xì)后端粗圓，成稍彎曲的長橢圓形。褐飛虱主要產(chǎn)卵在抽穗揚花期的水稻植株上，以卵塊形式產(chǎn)在水稻植株下部的葉鞘內(nèi)，卵期一般為7－11天。若蟲階段分為五個時期，大概為10－15天，分別稱為1-5齡若

69、蟲。成蟲暗褐色或淡褐色，體長3-5毫米，分長翅型和短翅型兩種。長翅型褐飛虱的翅長超過腹部，體形為梭狀；短翅型褐飛虱的翅短于腹部，體形肥短，行為笨拙。長、短翅型的分化主要受基因控制，但溫度、濕度、光照、稻株營養(yǎng)、蟲口密度等環(huán)境因子也能影響翅型的分化（劉光杰等，2000）。</p><p>　　褐飛虱的生長發(fā)育最適宜溫度為26－28℃，溫度高于30℃或低于20℃對若蟲的孵化和生存率、成蟲繁殖等都有不利的影響。一般初夏

70、不熱、晚秋不涼時節(jié)、相對濕度80%以上，最適合褐飛虱的生長發(fā)育。褐飛虱是遷飛性昆蟲，在一定條件下其長翅型成蟲能隨氣流上升，并在風(fēng)力幫助下作遠(yuǎn)距離遷徙。隨季風(fēng)遠(yuǎn)距離遷飛是造成褐飛虱在亞洲地區(qū)迅速地大面積爆發(fā)的主要途徑。（國際褐飛虱會議論文集 1980）。</p><p>　　1.2 褐飛虱生物型的定義及演化</p><p>　　現(xiàn)今昆蟲學(xué)上所稱的“biotype”是抗蟲育種研究先驅(qū)Paint

71、er于30年代提出的，中文譯名有生物型、生物小種等。生物型的定義分為廣義和狹義兩種：廣義的是指同種昆蟲的不同群體，當(dāng)它們生活在特定的寄主時，能表現(xiàn)出不同的發(fā)育和生存能力，或者說對寄主取食和產(chǎn)卵具有不同的嗜好性；狹義的是指同種昆蟲具有不同的致害性的個體或群體，當(dāng)它們?yōu)楹哂胁煌剐赃z傳基因的作物品種時，反映出不同的致害性。</p><p>　　根據(jù)褐飛虱種群對具有不同抗性基因的標(biāo)準(zhǔn)鑒定品種的致害性反應(yīng)，已有I、II

72、、III、IV、V以及孟加拉共6種生物型被國際水稻研究所正式命名，以后陸續(xù)又在菲律賓的棉蘭老島、孟加拉、印度、尼泊爾、澳大利亞以及越南的九龍江等地發(fā)現(xiàn)新的褐飛虱致害種群（周亦紅等，2003）。除以上這些危害水稻的生物型外，1984年在菲律賓和印度尼西亞還發(fā)現(xiàn)一種能危害李氏禾（Leersia haxandra），而不能危害水稻的褐飛虱種群，稱之為李氏禾生物型（Heinrichs & Madrano, 1984）。在已經(jīng)報道的這些生

73、物型中，以I、II、III生物型研究最為深入。生物型I是只能在不含任何抗蟲基因的品種上存活的褐飛虱群體；生物型II是只能在含Bph1的抗蟲品種，但不能在含bph2的抗蟲品種上存活的褐飛虱群體；生物型III可以在含bph2的抗蟲品種上存活的褐飛虱群體，其目前只在菲律賓國際水稻研究所實驗室中分離到，在田間還未發(fā)現(xiàn)（Khush & Brar 1991）。</p><p>　　生物型的分化是在長期的相互作用中，昆

74、蟲和寄主植物協(xié)同進化的結(jié)果；目前認(rèn)為在“種”的分化過程中，生物型是其過渡單元之一，是“種”的分化的一種連續(xù)性和間斷性的表現(xiàn)。一般來說，生物型產(chǎn)生的原因有選擇壓力、基因突變和雜交等。選擇壓力表現(xiàn)為：包括褐飛虱在內(nèi)的天然的害蟲群體本身具有遺傳性質(zhì)，存在或多或少的差別，對不同抗性作物品種的致害性也不同。當(dāng)受到抗蟲品種選擇壓力的持續(xù)影響時，群體中具有致害力的個體得以存活，并在繁殖過程中逐漸形成優(yōu)勢群體，隨即新的生物型就產(chǎn)生了。基因突變則是通過環(huán)

75、境的急劇的改變，使害蟲產(chǎn)生適應(yīng)環(huán)境改變的抗性表型，從而形成新的生物型。遺傳差別較大的個體，則通過個體間雜交產(chǎn)生新的致害基因的組合，再經(jīng)過不斷的選擇，演變?yōu)橐粋€新的生物型。生物型的形成是一個非常復(fù)雜的進化過程，受到宿主本身、寄生的植物以及環(huán)境因素等多方面相互作用的影響。</p><p>　　不同生物型褐飛虱的存在使得鑒定抗蟲基因復(fù)雜化，也造成育種的難度加大。當(dāng)一種抗蟲品種推廣后，容易造成新生物型的產(chǎn)生，從而使原有的

76、抗蟲品種“喪失”相應(yīng)的抗性，造成嚴(yán)重的蟲害。1973年，國際水稻所推出水稻品種IR26（含抗蟲基因Bph1），兩年后在菲律賓、印度尼西亞和越南先后出現(xiàn)了能為害該品種的生物型II。1975年在這些地方國際水稻所又推出了具有抗蟲基因bph2的品種如IR36和IR42，結(jié)果幾年后就出現(xiàn)了能克服這一抗性的生物型III。（Huang, 2001）</p><p>　　1.3 褐飛虱的取食及其為害</p>&l

77、t;p>　　褐飛虱的主要寄主是水稻，另外一些野生稻和稗草也有可能成為褐飛虱的寄主。褐飛虱喜歡陰暗、潮濕的環(huán)境，其成蟲、若蟲一般聚集在水稻下部，吸取韌皮部汁液（Rubia & Heong, 1989）。褐飛虱大面積爆發(fā)時，每一稻兜基部常聚集有數(shù)千頭褐飛虱，引起稻株下部枯黃、變黑，造成稻株癱瘓倒伏，以及稻田成片枯萎，一般把這種現(xiàn)象稱為“飛虱火燒”（Sōgawa, 1982）。近年來，褐飛虱在亞洲地區(qū)頻繁爆發(fā)，造成水稻大面積的減

78、產(chǎn)（Normile, 2008）。</p><p>　　褐飛虱具備刺吸式口器，是典型的吸食維管束韌皮部汁液的昆蟲，通過針刺和吸食水稻汁液對水稻造成直接危害（Wang et al., 2008b）。褐飛虱的成蟲、若蟲都能危害水稻。水稻植株在受到大量褐飛虱的取食為害后，出現(xiàn)葉片及莖稈變黃，然后擴展到地上所有部分，最終導(dǎo)致植株死亡（國際褐飛虱會議論文集 1980）。在生理學(xué)的角度來看，褐飛虱連續(xù)取食韌皮部汁液，導(dǎo)致韌皮

79、部傳導(dǎo)功能喪失，光合產(chǎn)物向根部的運輸受阻，進而擾亂根系的生理活動，加速葉片衰老（Watanabe & Kitagawa, 2000）。據(jù)測算，在中國和越南地區(qū)，由褐飛虱引起的水稻減產(chǎn)就到達了2770和700萬噸。目前普遍認(rèn)為褐飛虱對水稻的危害是造成自2003年來糧食價格上漲的主要原因（IRRI, 2008）。</p><p>　　除直接為害外，褐飛虱還可以間接的方式為害水稻。一種是產(chǎn)卵刺傷植株組織，產(chǎn)生的

80、大量傷口使水稻的傳輸組織遭到破壞，從而阻礙營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，加速了水稻的倒伏。另外褐飛虱能傳播或誘發(fā)水稻的很多病菌，如水稻病毒病、草叢矮縮病和齒葉矮縮病，導(dǎo)致病害的發(fā)生 （Du et al., 2007）。此外，褐飛虱在取食及產(chǎn)卵時，造成水稻基部的大量傷口，使水稻基部外面的糖分增多，形成霉變，有利于水稻小球菌核病的侵染和為害。</p><p>　　1.4水稻抗褐飛虱資源的挖掘和抗褐飛虱基因的研究</p>

81、<p>　　由于目前種植的水稻大部分都是感褐飛虱的品種，所以主要依靠化學(xué)殺蟲劑來防治褐飛虱。然而，殺蟲劑對人畜均有危害，殘余的化學(xué)毒物難以降解，污染環(huán)境和糧食。而且殺蟲劑的過度使用殺死了褐飛虱的天敵，并使褐飛虱產(chǎn)生了抗藥性，導(dǎo)致了褐飛虱的“再猖獗”（Tanaka et al., 2000）。因此，最經(jīng)濟、對環(huán)境最友好的防治褐飛虱的策略是：選用高產(chǎn)抗蟲的水稻品種，改善栽培措施、合理布局，并保護好褐飛虱的天敵，進行害蟲綜合防治

82、（integrative pest management, IPM）（Khush, 2001）。</p><p>　　自上世紀(jì)60年代末第一次報道栽培稻Mudgo是抗褐飛虱水稻品種以來（Pathak et al., 1969），人們已經(jīng)在野生稻和栽培品種中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了很多抗褐飛虱水稻品種（Khush & Brar, 1991; Zhang, 2007）。但是抗褐飛虱水稻品種的大面積種植引發(fā)了褐飛虱生物型的迅

83、速演變，這就要求在抗蟲育種中使用多樣化的抗源，培育具有不同抗性基因的品種以抵御不同生物型的褐飛虱。稻屬有20個野生種，具有豐富的遺傳多樣性和栽培稻中所沒有的優(yōu)異特性。1988年，IRRI對野生稻的16個種﹑4個野生稻×栽培稻的天然雜種共180多份資源進行抗蟲鑒定，篩選出抗褐虱生物型I的材料87份，抗生物型II的材料66份和抗生物型III的材料78份。它們主要屬于緊穗野生稻（O.eichingeri）﹑小粒野生稻（O.minut

84、a）﹑藥用野生稻（O.officinalis）和澳洲野生稻（O.australiensis）。這些材料為抗褐飛虱育種提供了豐富的潛在供體。我們實驗室經(jīng)過多年的研究，從藥用野生稻（O. officinalis）和寬葉野生稻（O. latifolia）轉(zhuǎn)育得到了一系列的新的高抗褐飛虱</p><p>　　抗褐飛虱基因的定位研究開始于70年代，以Athwal等研究Bph1和bph2為起點（Athwal et al.,

85、1971），隨后Lakshminarayana和Khush又發(fā)現(xiàn)了Bph3和bph4（Lakshminarayana & Khush, 1977）。多年來，各國科學(xué)家都試圖鑒定、定位乃至最終克隆水稻抗褐飛虱基因。到目前為止，根據(jù)抗性基因?qū)Σ煌镄秃诛w虱的抗性反應(yīng)，在栽培稻和野生稻中已鑒定并定位21個抗褐飛虱基因，并且有些已經(jīng)應(yīng)用到了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中（表1-1；Zhang, 2007）。包括13個顯性基因（Bph1, Bph3, Bp

86、h6, Bph9, Bph10, Bph11, Bph13, Bph14, Bph15, Bph17, Bph18, Bph20和Bph21）和8個隱性基因（bph2, bph4, bph5, bph7, bph8, bph12, bph16和bph19）。從目前已經(jīng)定位的21個抗褐飛虱基因可以看出，水稻抗褐飛虱基因多集中于水稻的第4號和第12號染色體。</p><p>　　抗褐飛虱基因轉(zhuǎn)育成的材料（如國際水稻所

87、的IR系列）雖然對褐飛虱防治做了一定的貢獻，但是由于單個抗蟲基因所具備的不穩(wěn)定性，使得在單一選擇壓力下容易產(chǎn)生新的褐飛虱生物型克服該育成的材料，進而造成更為嚴(yán)重的損失。因此，近幾年來對褐飛虱抗性的研究多集中于數(shù)量性狀的研究。雖然單個位點產(chǎn)生的效應(yīng)比較小，但多個數(shù)量性狀位點在水稻品種中的存在能給水稻提供更為持久的抗性，使得水稻品種不易被新生物型的褐飛虱克服；另外分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和在分子標(biāo)記輔助選擇下使得對許多復(fù)雜性狀的數(shù)量性狀位點（qu

88、antitative trait locus , QTLs）定位越來越簡便易行，定位結(jié)果更加精細(xì)可靠。1998年Alam</p><p>　　表1-1：水稻抗褐飛虱基因與褐飛虱生物型的相互關(guān)系</p><p>　　Table 1-1: Relationship between BPH resistance genes and BPH biotypes</p><p>

89、;　　a R，抗性；S，感性；-，不詳。</p><p>　　a R, Resistance; S, Susceptible; -, unknown.</p><p>　　Cohen首先以IR64/Azucena組合的含123個單株的雙單倍體（double-haploid lines，DH）群體為材料，在水稻中定位了抗菲律賓生物型的7個數(shù)量性狀基因； Xu等2002年 以160個Teqin

90、g/Lemont的重組自交系為材料，在Lemont中定位了抗褐飛虱生物型II的7個數(shù)量性狀基因，同時他們結(jié)合不同的抗蟲鑒定的方法初步分析了各位點的抗蟲機制，提出了分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合傳統(tǒng)育種技術(shù)對抗褐飛虱QTLs進行聚合的可能性和重要意義。以上這些抗褐飛虱基因的鑒定和初步的分子定位研究都為最終克隆抗褐飛虱基因提供了良好的基礎(chǔ)。</p><p>　　2. 植物對昆蟲抗性研究進展</p><p&g

91、t;　　昆蟲與植物之間相互關(guān)系的研究由來已久。1964年Ehrlich和Raven提出了協(xié)同進化（coevolution）的概念后，植物與昆蟲相互作用的研究得到了快速發(fā)展。目前，以害蟲和宿主植物的相互作用為基礎(chǔ)將植物抗蟲性的機制劃分為趨避性（Antixenosis）、抗生性（Antibiosis）和耐受性（Tolerance）（Painter, 1951; Alarn & Cohen, 1998）。</p><

92、;p>　　趨避性表現(xiàn)為：抗蟲植物自身的特性，如生理生化的特性或者是二者的綜合作用，甚至還可能包括視覺的特性，使害蟲在選擇過程中，不喜歡在該種植物上棲息、取食或產(chǎn)卵。</p><p>　　抗生性是指害蟲雖然可以在植物上取食、產(chǎn)卵和棲息，但是由于植物具備某些抗蟲機制，從而造成對害蟲的種種不利反應(yīng)，如使害蟲活動困難，取食減少，繁殖力下降，生長發(fā)育遲緩，體重減輕，軀體變小，死亡率增高等，因此是害蟲不能正常生長、發(fā)育

93、和繁殖。植物這一方面的特性可能包括一些毒性物質(zhì)（toxin）、取食、消化方面的蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitors）、昆蟲生長抑制因子（growth inhibitors）等。這一類抗蟲機制能直接降低害蟲的取食量、生長、繁殖和成活率，進而抑制其種群數(shù)量。</p><p>　　耐受性是指害蟲可以取食植物，植物并不能引起害蟲的死亡，植物能夠承受組織損傷，不造成植物的生長和存活的性狀。耐受性與植物受

94、到蟲害后的補償性生長有關(guān)。比如，蟲害雖然造成植物一定的損失，但也能誘導(dǎo)植物的光合能力和營養(yǎng)吸收能力的增強，并誘導(dǎo)光合作用產(chǎn)物在植物莖和地下器官中的積累。害蟲能在具有耐受性特點的植物上正常生長、發(fā)育和繁殖，但在蟲量還沒有多到使植物遭受嚴(yán)重?fù)p害的情況下，植株的耐害性機制能夠耐受害蟲的侵害而不至于顯著降低產(chǎn)量和質(zhì)量。</p><p>　　近年來，通過對植物和昆蟲相互作用的分子機理的研究，特別是植物抗蟲信號傳導(dǎo)途徑的研究

95、，我們可以將植物對昆蟲的反應(yīng)簡單的分為直接防御反應(yīng)和間接防御反應(yīng)兩種，由于這種劃分跟分子機理的結(jié)合使得更容易被系統(tǒng)的理解和接受（圖1-1）。</p><p>　　圖1-1：植物防御昆蟲取食模型。植食性昆蟲在取食過程中，對植物體造成傷害，并把引發(fā)子（effector）分泌到植株收到傷害的部位。傷害、專一性引發(fā)子以及其他非生物脅迫等以不同的方式激活了植物體內(nèi)各種信號傳導(dǎo)通路。信號級聯(lián)反應(yīng)的互作直接導(dǎo)致?lián)]發(fā)物信號分子的

96、產(chǎn)生，從而引發(fā)間接防御，或者對植物體內(nèi)的代謝途徑作出調(diào)整，并表達防御相關(guān)蛋白。最終使植物體產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性——耐受性、直接防御和間接防御。(Kessler & Baldwin 2002)</p><p>　　Fig. 1-1. Model of plant defense to insect herbivory. The arena of plant-induced resistance to arthrop

97、ods an attacking herbivore wounds the plants and applies or injects elicitors. Wound- and herbivore-specific elicitors in combination with abiotic stresses differentially activate various signaling pathways. These signal

98、 cascades interact to either directly produce volatile signals that function as indirect defenses or effect a fine-tuned metabolic reconfiguration and the expression of defense-r</p><p>　　2.1 植物對昆蟲的直接防御</

99、p><p>　　植物在長期的進化過程中形成了如硅石、香毛簇、荊棘、初級及次級代謝物之類的生理生化特性，能夠直接影響昆蟲棲息、取食、生長、發(fā)育和繁殖，增強了植物對昆蟲的抗性和植物適應(yīng)環(huán)境的能力。其中物理特性包括一些物理屏障，如胼胝質(zhì)、厚角質(zhì)層、木栓、毛、刺等；化學(xué)特性包括揮發(fā)性驅(qū)蟲物質(zhì)、毒性物質(zhì)、消化酶抑制劑等。植物受到昆蟲的侵害后，往往采取主動的防御反應(yīng)，如迅速產(chǎn)生大量的抗性蛋白和有毒次生化合物等，它們是直接防御系統(tǒng)

100、最重要的組成部分。這種防御方式總體上可以分為3 類：（1）揮發(fā)性物質(zhì)，能引起昆蟲避開或抑制昆蟲取食，使覓食的昆蟲不愿意或者阻遏昆蟲在植物體繼續(xù)取食；（2）防御蛋白（如蛋白酶抑制劑、多酚氧化酶等），能抑制昆蟲對食物的消化能力；（3）毒性的次生代謝物，可以使昆蟲中毒死亡，或降低繁殖力，延遲生長發(fā)育，從而免于植物蒙受更大的損害。（Duffey & Stout, 1996）</p><p>　　2.1.1 植物中

101、抗蟲作用的抑制劑</p><p>　　蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitor, PI）是一類能夠與蛋白水解酶緊密結(jié)合從而抑制其活性的蛋白質(zhì)。昆蟲取食了含高濃度PIs的植物后，PIs與昆蟲腸道的蛋白酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而導(dǎo)致昆蟲的蛋白消化酶活性受到抑制，使昆蟲嚴(yán)重缺乏氨基酸，進而導(dǎo)致昆蟲的胰蛋白酶過度分泌和含硫氨基酸的過度消耗（Ryan, 1990）。目前，植物中已發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)蛋白酶抑制劑都是胰蛋

102、白酶抑制劑（trypsin inhibitor）和胰凝乳蛋白酶抑制劑（chymotrypsin inhibitor）（Koiwa et al., 1997）。另外PIs也可抑制微生物的蛋白酶活性，因此在植物的抗病反應(yīng)中它們也起著重要作用（Ryan, 1990）。</p><p>　　淀粉酶抑制劑（amylase inhibitor, AI）是特異地抑制昆蟲淀粉酶的一種或一類蛋白酶。主要存在于動物、植物和微生物體內(nèi)

103、，禾本科和豆科植物籽實中含有多種類型的淀粉酶抑制劑。一般認(rèn)為，昆蟲淀粉酶抑制劑對昆蟲的防御作用主要是與昆蟲淀粉酶的活性位點結(jié)合形成穩(wěn)定的酶–抑制劑（EI）復(fù)合物，從而抑制淀粉酶的活性，進而使昆蟲攝取的淀粉不能消化，使昆蟲缺乏主要的能量來源。同時，EI 復(fù)合物也會刺激昆蟲的消化腺過量分泌消化酶，通過神經(jīng)系統(tǒng)的反饋，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應(yīng)，影響昆蟲正常的生化過程和生理代謝（Valencia et al., 2000）。</p>&

104、lt;p>　　凝集素（lectin）是一類可逆結(jié)合的特異單糖或寡糖的蛋白質(zhì)。目前認(rèn)為植物凝集素含有至少一個能夠可逆結(jié)合到單糖或寡糖上的非催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。目前認(rèn)為植物凝集素的抗蟲機理有三種可能的作用類型：1. 凝集素結(jié)合到昆蟲腸道圍食膜的幾丁質(zhì)上；2. 結(jié)合到昆蟲的消化道上皮細(xì)胞的糖基化合物上；3. 結(jié)合到昆蟲中腸糖基化的消化酶上。這些結(jié)合影響昆蟲正常吸收營養(yǎng)物質(zhì)，同時還可誘發(fā)昆蟲消化道內(nèi)的病灶，促進其消化道內(nèi)細(xì)菌繁殖，抑制昆蟲

105、生長發(fā)育，從而達到殺蟲目的（Chrispeels & Raikhel, 1991）。雪花蓮凝集素（Galanthus nivalis agglutinin, GNA）是目前發(fā)現(xiàn)的對蚜蟲、褐飛虱、葉蟬等同翅目刺吸式口器害蟲最有效的植物凝集素。將韌皮部特異表達啟動子RSsl （水稻蔗糖合成酶1基因的啟動子）與編碼雪花蓮凝集素的基因gna構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，轉(zhuǎn)化栽培稻后，得到的轉(zhuǎn)基因植株，可以降低褐飛虱的生存率、產(chǎn)卵率，延緩昆蟲的發(fā)育，且抑