華南瓜類(lèi)疫霉種群多樣性及其化學(xué)防治研究.pdf

1、由疫霉菌引起的瓜類(lèi)疫病是世界性病害，據(jù)報(bào)道，該病由多種疫霉菌引起，目前該病已成為瓜類(lèi)生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一；因病原菌的多樣化和抗藥性使得對(duì)該病的防治極為困難。為了解近年華南地區(qū)冬瓜及黃瓜疫病病原菌的構(gòu)成和病原種群的動(dòng)態(tài)變化，本文對(duì)近4年來(lái)從廣西和廣東兩省(區(qū))不同瓜類(lèi)產(chǎn)區(qū)分離到的193株疫霉菌進(jìn)行系統(tǒng)研究，從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方面進(jìn)行了鑒定，測(cè)定了部分代表菌株的生物學(xué)特性，開(kāi)展了病原菌的抗藥性檢測(cè)與監(jiān)測(cè)、交配型及其分布調(diào)查、致病性分

2、化及遺傳多樣性的RAPD分析研究，并對(duì)冬瓜疫病的化學(xué)防治進(jìn)行了初步研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、2007～2010年從廣西、廣東兩省(區(qū))9個(gè)冬瓜、黃瓜產(chǎn)區(qū)采集疫病病株，經(jīng)分離純化共獲得193株疫霉菌，對(duì)其中10株代表菌株的形態(tài)、培養(yǎng)性狀、寄主范圍等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，并對(duì)其中89株的rDNA-ITS區(qū)域的序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在OA培養(yǎng)基上，10株代表菌株(CZ-1，GL-9，GZ-4，LZ-5，NN-20，NN-

3、27，NN-29，YD-6，YL-2和YL-9)氣生菌絲較均勻一致，基質(zhì)菌絲膨大體常見(jiàn)。孢子囊呈卵形、橢圓形到長(zhǎng)橢圓形，無(wú)乳突，孢囊梗不脫落。孢囊梗一般不分支，孢子囊有內(nèi)層出現(xiàn)象。絕大多數(shù)菌株表現(xiàn)異宗配合特性，藏卵器球形，壁光滑，基部多呈棍棒形，雄器穿雄生。卵孢子球形，滿器，偶有不滿器。最適生長(zhǎng)溫度25～31℃，最高生長(zhǎng)溫度高于37℃。最適生長(zhǎng)pH值范圍5～7.5，但多數(shù)菌株在偏酸性(pH5～6)條件下生長(zhǎng)較好。病原菌能利用多種碳氮源，

4、對(duì)孔雀石綠有一定的耐性，人工接種能?chē)?yán)重侵染冬瓜、黃瓜、節(jié)瓜、西瓜、甜瓜等葫蘆科作物，對(duì)茄科、十字花科、傘形科的部分植物(如馬鈴薯、大白菜、上海青、胡蘿卜)也具較強(qiáng)致病力。將89株供試菌的rDNA-ITS序列與在GenBank中已有的相關(guān)菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明所有供試菌株與瓜類(lèi)疫霉Phytophthora melonis和中國(guó)疫霉P.sinensis的同源性最高。對(duì)基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的48株疫霉菌的分

5、子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析結(jié)果表明，在自舉值為99%的水平上供試10株代表菌株與瓜類(lèi)疫霉P.melonis和中國(guó)疫霉P.sinensis聚成一群，明顯不同于34株其他疫霉菌，表明供試瓜類(lèi)疫病菌株應(yīng)歸入瓜類(lèi)疫霉P.melonis和中國(guó)疫霉P.sinensis種內(nèi)。結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)及rDNA-ITS序列分析，將引起華南廣東、廣西兩省(區(qū))冬瓜及黃瓜疫病的病原菌鑒定為瓜類(lèi)疫霉P.melonis(異名：P.sinensis)。
　　

6、 2、采用菌絲塊無(wú)傷接種法，測(cè)定193株瓜類(lèi)疫霉對(duì)供試寄主植物冬瓜和黃瓜的致病力差異及其寄主嗜好性。結(jié)果表明，病原群體對(duì)寄主植物冬瓜和黃瓜的致病力均存在明顯分化現(xiàn)象，可分為強(qiáng)致病力、中等致病力及弱致病力3大類(lèi)群；來(lái)自不同地區(qū)的瓜類(lèi)疫霉對(duì)寄主植物冬瓜和黃瓜的致病力明顯不同，多數(shù)樣區(qū)以強(qiáng)致病力菌株占優(yōu)勢(shì)。瓜類(lèi)疫霉種群中至少存在3種寄主嗜好型(A，B和C型)菌株，A型菌株對(duì)冬瓜和黃瓜均表現(xiàn)強(qiáng)致病力，與原始分離寄主無(wú)關(guān)；B型菌株僅對(duì)原始分離寄主

7、冬瓜表現(xiàn)強(qiáng)致病力，而對(duì)黃瓜則表現(xiàn)為弱或中等致病力；C型菌株僅對(duì)原始分離寄主黃瓜表現(xiàn)強(qiáng)致病力，而對(duì)冬瓜則表現(xiàn)為弱或中等致病力。本研究明示了華南瓜類(lèi)疫霉致病力分化的存在。
　　 3、對(duì)從華南地區(qū)分離到的193株瓜類(lèi)疫霉進(jìn)行抗藥性檢測(cè)，結(jié)果表明，敏感菌株、中等抗性菌株和抗性菌株分別占測(cè)試菌株的29.0%、18.1%和52.8%；不同地區(qū)、不同寄主分離的菌株的抗性頻率和抗性水平差異較大，來(lái)源于廣東的菌株抗性頻率和抗性水平一般高于來(lái)源廣西

8、的菌株，分離自黃瓜的菌株高于分離自冬瓜的菌株。大部分樣點(diǎn)抗性菌株占據(jù)優(yōu)勢(shì)群體，個(gè)別菌株的抗性指數(shù)高達(dá)4226.9。葉盤(pán)漂浮法測(cè)定結(jié)果和菌落生長(zhǎng)速率法相似。在含藥平板上對(duì)敏感菌株進(jìn)行甲霜靈抗性誘導(dǎo)結(jié)果表明，從60%的敏感菌株中成功誘導(dǎo)出對(duì)甲霜靈抗性穩(wěn)定的突變體，突變體的抗性水平為敏感性親本的189～407倍；9株來(lái)源于未施用過(guò)甲霜靈等苯基酰胺類(lèi)殺菌劑樣點(diǎn)的菌株均為敏感性菌株，其EC50值為0.0429～0.5461μg/mL，將它們EC5

9、0的平均值0.3200±0.1617μg/mL確定為華南地區(qū)瓜類(lèi)疫霉對(duì)甲霜靈的敏感性基線；對(duì)兩個(gè)樣點(diǎn)的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，瓜類(lèi)疫霉抗甲霜靈菌株的頻率及抗性指數(shù)有逐年增高趨勢(shì)。華南廣西和廣東兩省(區(qū))瓜類(lèi)疫霉對(duì)甲霜靈抗性普遍發(fā)生，瓜類(lèi)疫霉對(duì)甲霜靈抗藥性產(chǎn)生與其和藥劑的接觸密切相關(guān)。
　　 4、采用直接配對(duì)法對(duì)193株瓜類(lèi)疫霉進(jìn)行交配型測(cè)定，共檢測(cè)到5種交配型。各種交配型中，以A2交配型占據(jù)優(yōu)勢(shì)，占群體的51.8%；其次為A0交配型占24

10、.9%；A1，A2交配型的比例最少，僅2株占1.0%。桂林的瓜類(lèi)疫霉以A0交配型占優(yōu)勢(shì)，比例為40.9%，其它地區(qū)的瓜類(lèi)疫霉則以A2交配型占據(jù)優(yōu)勢(shì)，比例為37.5～66.7%，來(lái)自兩種寄主的瓜類(lèi)疫霉都檢測(cè)到4種交配型的存在，且均以A2交配型占優(yōu)勢(shì)，其中3種交配型(A2、A1A2和A0)為來(lái)自兩種寄主的瓜類(lèi)疫霉所共有，A1交配型為冬瓜疫病菌獨(dú)有，而A1，A2則為黃瓜疫病菌獨(dú)有，表明瓜類(lèi)疫霉的部分交配型菌株對(duì)寄主有專化性。桂林的瓜類(lèi)疫霉的A

11、1和A2交配型菌株數(shù)比值接近1:1，初步確定桂林處于瓜類(lèi)疫霉起源中心的范圍內(nèi)，可以推測(cè)亞洲是瓜類(lèi)疫霉的起源中心。
　　 5、從180條RAPD(random amplified polymorphic DNAs)隨機(jī)引物中所篩選出的多態(tài)擴(kuò)增性強(qiáng)、重復(fù)性好的12條引物，對(duì)華南9個(gè)不同地區(qū)的96株瓜類(lèi)疫霉進(jìn)行全基因組DNA遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建。選用引物對(duì)供試菌株進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，共產(chǎn)生135條DNA標(biāo)記圖帶，其中12

12、4條為多態(tài)性圖帶，多態(tài)檢測(cè)率為91.9%。利用NTSYSpc Version2.1軟件對(duì)供試菌株間的遺傳距離進(jìn)行聚類(lèi)分析并構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)狀圖，以遺傳相似系數(shù)為0.81為閾值，將96株供試菌劃分為12個(gè)RAPD群，多數(shù)分離物之間遺傳相似性較低，在DNA水平上存在顯著的遺傳變異，具有較豐富的遺傳多樣性。RAPD群的劃分與地理來(lái)源、分離寄主、致病力、交配型及甲霜靈抗性水平等表型特征均無(wú)明顯的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，不同地區(qū)間菌株的遺傳分化不同，分離

13、自黃瓜的菌株其遺傳分化明顯高于分離自冬瓜的菌株。
　　 6、為了篩選出防治瓜類(lèi)疫霉所致黑皮冬瓜疫病的高效藥劑，對(duì)19種常見(jiàn)商品殺菌劑對(duì)瓜類(lèi)疫霉的室內(nèi)抑制力進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)部分殺菌劑進(jìn)行冬瓜疫病的盆栽和大田防效試驗(yàn)。室內(nèi)抑制力測(cè)定結(jié)果表明：烯酰嗎啉(商品名：安克)和氟嗎啉+代森錳鋅(商品名：施得益)對(duì)病原菌的抑制力最強(qiáng)，生長(zhǎng)抑制率分別為89.36%和87.43%；其余依次為霜脲氰+代森錳鋅(商品名：克露)53.07%、甲霜靈+代森

14、錳鋅(商品名：金雷多米爾)51.43%、噁霜靈+代森錳鋅(商品名：殺毒礬)46.57%、代森錳鋅(商品名：大生M-45)46.00%、敵磺鈉(商品名：敵克松)45.86%、乙磷鋁+代森鋅40.43%；其它殺菌劑對(duì)病原菌的生長(zhǎng)抑制率均在40%以下；嘧菌酯(商品名：阿米西達(dá))、異菌脲(商品名：撲海因)和惡霉靈的毒性最弱，抑制率均為0%。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明：烯酰嗎啉和氟嗎啉+代森錳鋅有很好的保護(hù)作用，防治效果達(dá)100%；其次為敵磺鈉、百菌清、乙