羊鼻蠅蛆病病理學(xué)及鼻黏膜免疫學(xué)研究-獸醫(yī)學(xué)碩士論文

1、<p>　　分類號 S828 學(xué)校代碼 10129 </p><p>　　U D C 11.220 學(xué) 號 08201051</p><p>　　羊鼻蠅蛆病病理學(xué)及鼻黏膜免疫學(xué)研究</p><p>　　Resear

2、ch of Pathological and Immunology </p><p>　　of Nasal mucosa on Oestrus ovis </p><p><b>　　申 請 人：杜長春</b></p><p><b>　　學(xué)科門類：農(nóng) 學(xué)</b></p><p>　　學(xué)科專業(yè)：基

3、礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)</p><p>　　研究方向：動(dòng)物傳染病與免疫病理學(xué)</p><p>　　指導(dǎo)教師：王鳳龍 教授</p><p>　　論文提交日期：二〇一一年四月</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　通過對山西黃土高原區(qū)域羊鼻蠅蛆感染情況調(diào)查、病理學(xué)及鼻黏膜免疫學(xué)的研究

4、，以明確該地區(qū)羊鼻蠅蛆的感染率、該病的病理學(xué)及鼻黏膜免疫學(xué)變化。從春季至秋季對羊鼻蠅蛆感染情況進(jìn)行調(diào)查，對307例綿羊進(jìn)行羊頭剖檢，檢查羊鼻蠅蛆病的各齡幼蟲感染情況，同時(shí)觀察病理變化，并采取感染羊的鼻黏膜、咽后淋巴結(jié)、腦和肺組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，采用ELISA檢測鼻腔分泌物IgA、IgG含量，通過流式細(xì)胞儀對鼻黏膜、咽后淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測。春季檢查157例，鼻蠅蛆感染患羊34例，感染率達(dá)22%；秋季檢查150例，感染患羊7

5、0例，感染率達(dá)47%；春秋兩季平均感染率為34%。鼻蠅蛆感染綿羊鼻黏膜出現(xiàn)不同損傷和增生性炎，咽后淋巴結(jié)炎性細(xì)胞浸潤，有的病例出現(xiàn)肺氣腫，腦組織水腫。檢出蟲體的羊與未檢出蟲體羊比較，咽后淋巴結(jié)IgA分泌細(xì)胞和IgG分泌細(xì)胞呈增高趨勢，尤其是淋巴結(jié)髓質(zhì)中IgA分泌細(xì)胞和IgG分泌細(xì)胞明顯增多；感染綿羊鼻腔分泌物中IgA、IgG水平顯著高于未感染綿羊，咽后淋巴結(jié)、鼻黏膜CD4+水平顯著性高于未感染綿羊，鼻黏膜CD8+水平較高于未感染綿羊，而

6、咽后淋巴結(jié)中CD8+水平二者無明顯差異，咽后淋巴結(jié)</p><p>　　關(guān)鍵詞：羊鼻蠅蛆；流行病學(xué)；病理學(xué)；鼻黏膜免疫學(xué)</p><p>　　Research of Pathological and Immunology of Nasal mucosa on Oestrus ovis </p><p><b>　　Abstract</b><

7、;/p><p>　　In order to make clear the area of sheep nasal flies maggots infection,the pathological changes and nasal mucosa immunology of the disease,we carried out an infection survey,pathology and nasal mucosa

8、 immunology study of Oestrus ovis in the loess plateau area in Shanxi province from spring to autumn. 307 samples were dissected to check the infection status of nasal flies maggots larvae, while histopathology methods w

9、ere used to observe pathological changes. And then，we examined the sheep nasal m</p><p>　　Key words: Oestrus ovis;Epidemiology;Pathology;Immunology of Nasal mucosa</p><p>　　Directed by: Prof Wan

10、g Fonglong</p><p>　　Applicant for Master degree: Du Changchun (veterinary pathology)</p><p>　　(Animal Science and Animal Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot, 010018, China)&

11、lt;/p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　1.1 羊鼻蠅蛆概述1</p><p>　　1.1.1 病原體及形態(tài)學(xué)1</p><p>　　1.1.2 流行病學(xué)1</p>&

12、lt;p>　　1.1.3 發(fā)育生物學(xué)2</p><p>　　1.1.4 免疫學(xué)診斷4</p><p>　　1.1.5 病理學(xué)4</p><p>　　1.1.6 危害及臨床癥狀4</p><p>　　1.1.7 羊鼻蠅蛆病的防治5</p><p>　　1.2 鼻腔免疫部分6</p>

13、;<p>　　1.2.1 鼻腔組織學(xué)特點(diǎn)6</p><p>　　1.2.2 鼻腔的免疫功能6</p><p>　　1.2.3 鼻相關(guān)淋巴組織7</p><p>　　1.2.4 鼻腔免疫研究進(jìn)展7</p><p>　　1.3 本課題研究的目的和意義9</p><p><b>　

14、　2 實(shí)驗(yàn)研究9</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)一 山西黃土高原地區(qū)羊鼻蠅蛆病流行病學(xué)調(diào)查及病理組織學(xué)觀察9</p><p>　　2.1.1 材料9</p><p>　　2.1.2 方法11</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果13</p><p>　　2.1.4 討論

15、18</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)二 羊鼻蠅蛆病鼻黏膜免疫應(yīng)答研究20</p><p>　　2.2.1 材料20</p><p>　　2.2.2 方法22</p><p>　　2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25</p><p>　　2.2.4 討論33</p><p><b&

16、gt;　　3 結(jié)論35</b></p><p><b>　　致 謝36</b></p><p>　　參 考 文 獻(xiàn)37</p><p>　　作 者 簡 介44</p><p>　　縮 略 語 表</p><p>　　ADCC （antibody-dep

17、endent cell-mediated cytotoxicity抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用</p><p>　　APC（antigen present cell） 抗原提呈細(xì)胞</p><p>　　ASC（antibdy secretory cells）

18、 抗體分泌細(xì)胞</p><p>　　CD4（helpercell） 輔助性T細(xì)胞</p><p>　　CD8（SUPPRESSOR T cell） 抑制/殺傷T淋巴

19、細(xì)胞</p><p>　　DC（dendritic cell） 樹突狀細(xì)胞</p><p>　　DMSO（dimethyl sulfoxide） 二甲基亞砜</p><p&

20、gt;　　FCA（Flow cytometric analysis） 流式細(xì)胞儀</p><p>　　GALT（gut-associated lymphoid tissue） 腸黏膜相關(guān)淋巴組織</p><p>　　ELISA（enzyme linkin

21、g immunosorbent assay） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)</p><p>　　HEV（high epithelialvenules） 后微靜脈</p><p>　　IgA（immunoglobulin A）

22、 免疫球蛋白A</p><p>　　IgG（immunoglobulin G） 免疫球蛋白G</p><p>　　IFN（interferon）

23、 干擾素</p><p>　　IL（intierleukin） 白細(xì)胞介素</p><p>　　M c（melnbranous cell） 微皺細(xì)胞&

24、lt;/p><p>　　MALT（mucosal-associated lymphoid tissue） 黏膜相關(guān)淋巴組織</p><p>　　NALT （Nose associated lymphoid tissue） 鼻腔黏膜相關(guān)淋巴組織</p><p>　　slgA（s

25、ecretory lgA） 分泌性lgA</p><p>　　TNF（tumor necrosis factor） 腫瘤壞死因子</p><p><b>　　1 引言</b>&l

26、t;/p><p>　　1.1 羊鼻蠅蛆概述</p><p>　　羊鼻蠅(Oestrus ovis Linnaeus,1761)亦稱羊狂蠅，屬雙翅目(Diptera)，狂蠅科(Oestridae)，狂蠅屬(Oestrus)[1]。羊鼻蠅蛆病是羊鼻蠅的幼蟲寄生在羊的鼻腔及其附近腔竇中引起羊只不安、呼吸困難、慢性鼻炎和額竇炎癥狀為主的寄生蟲侵襲疾病[2]。羊狂蠅宿主呈世界各地養(yǎng)羊區(qū)廣泛分布，感染率高

27、，成蠅飛行距離長[3]。該病主要危害綿羊，山羊受害較輕，在歐洲有寄生于駱駝和人的報(bào)道。羊狂蠅蛆病在我國西北、內(nèi)蒙古、東北地區(qū)感染較為嚴(yán)重，流行嚴(yán)重地區(qū)感染率可高達(dá)80% [1]。研究表明，患羊增重降低3.58%～8.29%，每只羊月均活重?fù)p失0.479～0.6kg[4]，而胴體肉損失達(dá) 1.19～4.6kg，羊毛損失200～500g，產(chǎn)奶量下降10%[5]，嚴(yán)重影響羊只生長發(fā)育并給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。</p><

28、p>　　1.1.1病原體及形態(tài)學(xué)</p><p>　　羊狂蠅成蟲的形態(tài)學(xué)特征的描述開始由Linne在分類時(shí)即進(jìn)行了論述，將成蟲翅脈的特征用來種的鑒定[6]。成蟲體長10～12毫米，淡灰色，略帶金屬光澤體態(tài)似蜜蜂，頭大呈黃色，口器已退化[1]，全身密生絨毛，胸部結(jié)節(jié)上長有細(xì)長毛，腹部長有銀白色閃光點(diǎn)。產(chǎn)完幼蟲（蛆）后，雌蠅立即死亡；雄蠅與雌蠅交配后，雄蠅立即死亡[7]。其不同齡期幼蟲間的形態(tài)學(xué)差異多采用Cap

29、elle[8]與Zumpt[3] 報(bào)道的分類鑒定方法。即Ⅰ期幼為淺黃白色，體長約 1mm，前方有兩個(gè)黑色強(qiáng)大的口鉤向后彎曲，口鉤高度角質(zhì)化。尾部末端突起上有10個(gè)或11個(gè)小刺。背部第3節(jié)片上有3排刺，其余節(jié)片上有2排完整的刺和位于中間部分的8～12個(gè)刺。腹面的每個(gè)節(jié)片上有3排刺，最后2節(jié)有不完整的第4排刺。Ⅱ期幼齡蟲體長9～20mm。體表的刺不明顯。Ⅲ期幼蟲體形似圓柱形，前端尖，強(qiáng)壯而彎曲，體長25～30mm。有兩個(gè)強(qiáng)大的黑色口前鉤，較

30、發(fā)達(dá)，內(nèi)部連接于咽部骨架上。蟲體背面無刺，成熟后各節(jié)上具有顏色深淺不一的帶斑(隨成熟程度不同顏色深淺不同)。腹面各節(jié)前端具有小刺約11列。蟲體后端平齊，凹處有兩個(gè)“D”型氣門板，中央有鈕孔，兩后氣門板明顯</p><p>　　Guitton[10]和Dorchies[11] 還對幼蟲進(jìn)行了電鏡掃描觀察，他們發(fā)現(xiàn)Ⅰ期幼蟲體表有許多小刺，且口鉤發(fā)達(dá)強(qiáng)壯；Ⅱ期幼蟲刺較少；Ⅲ期幼蟲腹側(cè)有很多小刺。</p>

31、<p><b>　　1.1.2流行病學(xué)</b></p><p>　　自上個(gè)世紀(jì)30年代以來，人們開始研究羊狂蠅蛆流行病學(xué)。目前，對羊狂蠅蛆的流行動(dòng)態(tài)已完成野外調(diào)查的國家有法國[12]、美國[13]、烏克蘭[14]、津巴布韋[2]、南非[15]、印度[16] 等。我國新疆石河子[17]、寧夏固原[18]和四川阿壩地區(qū)[19]做過一個(gè)完整年度的調(diào)查。</p><p&

32、gt;　　有關(guān)報(bào)道稱羊狂蛆原是一種古北區(qū)的物種，后隨人類和宿主動(dòng)物遷移而被帶往各地[6]；現(xiàn)在普遍認(rèn)為羊狂蠅蛆為全球性分布，由其幼蟲侵襲引起羊的狂蠅蛆病亦在世界各國養(yǎng)羊區(qū)廣泛流行[20]。如美國西南部羊狂蠅蛆感染率為91.5%，平均感染強(qiáng)度25.6[13]；法國西南部感染率為33.2%，強(qiáng)度為4.9[11]；烏克蘭感染率為58%～90%，強(qiáng)度為14[14]；非洲各養(yǎng)羊區(qū)普遍流行；南非感染率73.4%[21]。由于羊狂蠅的感染率隨地區(qū)差異

33、而變化較大，故只有調(diào)查地區(qū)相對一致才具有可比性。就同一地區(qū)而言，綿羊的感染率高于山羊[8]，夏秋季高于冬春季，幼齡羊高于成年羊[17]。羊狂蠅蛆病的致死率不高，偶而可由大量的蟲體阻塞呼吸道致患羊窒息或繼發(fā)病菌感染死亡[22]。其發(fā)病情況通常在夏秋季成蟲大批出現(xiàn)時(shí)以表現(xiàn)卡他性鼻炎為主要癥狀，采食羊只為躲避成蟲侵襲常將鼻孔緊帖于地面，或?qū)㈩^藏于其他羊只兩后肢中間；冬季無明顯癥狀，春季則多搖頭、打噴嚏[16]。</p><

34、p>　　羊鼻蠅的宿主特異性較強(qiáng)，通常寄生于羊科動(dòng)物[6]，主要是綿羊。但達(dá)胡巴雅爾等[23]報(bào)道還可寄生于駱駝和馴鹿，楊曉野等人研究表明馴鹿狂蠅蛆與羊狂蠅蛆不是一個(gè)種[22]。</p><p>　　1.1.3發(fā)育生物學(xué)</p><p>　　在羊狂蠅蛆各蟲態(tài)發(fā)育期的研究中對Ⅲ期幼蟲化蛹、羽化及成蟲的壽命研究報(bào)道比較多，如Cobbett and Mitchell[24]觀察美國新墨西哥和

35、德克薩斯羊狂蠅Ⅲ期幼蟲化蛹需13～72h，羽化需17～70天。印度的Jagannath[25]經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為化蛹需13～24h，羽化期17～37天，成蟲的壽命為3～25天[26]。Fallis[27]發(fā)現(xiàn)在加拿大成蟲的存活期為10～28天，大多數(shù)在16天。我國汪世鐘[28]，鄭經(jīng)鴻等[20]，張永森等[17]報(bào)道成蟲存活期為10天左右。</p><p>　　各國對羊狂蠅各期幼蟲寄生所需時(shí)間這一重要的報(bào)道較少，美國

36、的Cobbett[24]和Mitchell[29]首先于1933年剖檢僅有2.5～3.5月齡春羔時(shí)發(fā)現(xiàn)，并有成熟的Ⅲ齡幼蟲寄生，從而斷定幼蟲從Ⅰ期到Ⅲ期僅用2.5～3.5個(gè)月的時(shí)間。隨后他們捕獲到雌蠅，擠出其腹部的Ⅰ期幼蟲，然后人工感染羔羊，隔期剖殺檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期幼蟲發(fā)育為成熟的Ⅲ期幼蟲，在夏季僅需25～35天的時(shí)間，而在寒冷的季節(jié)里，幼蟲則以Ⅰ期幼蟲的蟲態(tài)滯育達(dá)9個(gè)月之久。因此，兩位學(xué)者據(jù)羊狂蠅在夏季化蛹羽化僅需17～70天，成

37、蟲壽命平均約16天的結(jié)論推斷：溫暖季節(jié)里羊狂蠅蛆整個(gè)生活周期約需3.5～4.5個(gè)月的時(shí)間。加拿大學(xué)者Fallis[27]同樣用剖檢春羔的方法發(fā)現(xiàn)，羊狂蠅幼蟲在初夏的寄生期僅需30天，這一點(diǎn)證實(shí)了Cobbett[24]和Mitchell[29]1933年的工作結(jié)論。Dorchies[11]等用同樣方法研究認(rèn)為夏季Ⅰ期到Ⅲ期幼蟲的發(fā)育時(shí)間不到20天。因此，本蟲在北方寒冷地區(qū)每年僅繁殖一代，而在溫暖地區(qū)則可每年兩代。根據(jù)前人對羊狂蠅幼蟲寄生期

38、的研究，對世界各地區(qū)羊狂蠅的年發(fā)生世代歸結(jié)如下：</p><p>　　表1 世界各地區(qū)羊狂蠅年發(fā)生世代時(shí)間表[30]</p><p>　　Table1.　The sequence of generation Oestrus ovis files occuring in the world</p><p>　　由表1可見，很多學(xué)者認(rèn)為北半球是一個(gè)統(tǒng)一模式[6、31]

39、。即成蠅于6月份羽化，交配產(chǎn)幼蟲，幼蟲迅速生長發(fā)育且于當(dāng)年7、8月份成熟為Ⅲ期幼蟲并離開宿主，這些幼蟲化蛹、羽化出秋季世代的成蟲，并于當(dāng)年9、10月份間產(chǎn)生幼蟲，這些幼蟲可以長期以Ⅰ期幼蟲的形式在羊鼻腔或鼻竇內(nèi)寄生，直到翌年3月份發(fā)育為成熟的Ⅲ期幼蟲，這些成熟幼蟲離開宿主、化蛹并在外界保持靜息狀態(tài)，直到6月份羽化為成蟲。這恰與南半球相反[21]。</p><p>　　由于蛹和成蟲是羊狂蠅整個(gè)生活史過程中生存于外界

40、的蟲態(tài)，因而受外界環(huán)境因素影響較大。因此有關(guān)于羊狂蠅這兩個(gè)階段的發(fā)育生態(tài)學(xué)研究報(bào)道較多。蛹的發(fā)育上限溫度與發(fā)育起點(diǎn)溫度是預(yù)測一個(gè)地區(qū)羊狂蠅發(fā)生情況的兩個(gè)重要生物學(xué)參數(shù)。Breev等[32]經(jīng)研究認(rèn)定，持續(xù)34℃高溫會促使蛹死亡，但日氣溫在21～30℃之間波動(dòng)的情況下卻不會影響蛹的死亡率，蛹的發(fā)育起點(diǎn)溫度為12℃，雄蟲的有效積溫為243日度，雌蟲為279日度。Knapp[33]和Rogers[31]則認(rèn)為32℃以上時(shí)蛹不能存活。</

41、p><p>　　羊狂蠅的蛹期會隨周圍環(huán)境溫度的升高而縮短[21、31、33]。Bukshtynov[34]發(fā)現(xiàn)最高溫度下僅用14天成蟲即可羽化。成蟲的羽化需要達(dá)到一定的溫度，但成蟲的繁殖與存活則在干燥環(huán)境比潮濕環(huán)境更為適宜，而干熱又優(yōu)于干涼氣候[9]。因此，一年中分為雨季與旱季的國家和地區(qū)，旱季往往是羊狂蠅成蟲出現(xiàn)的季節(jié)[2]。</p><p>　　寄生在羊鼻腔內(nèi)的幼蟲的發(fā)育速率并不是一致的，

42、它表現(xiàn)為時(shí)慢時(shí)快 [6、9]。I期幼蟲在涼爽的氣候下呈滯育狀態(tài)在鼻腔內(nèi)越冬[24、27、33]。而津巴布韋等冬季暖和的地區(qū)幼蟲則不滯育[2、9]。對冬季幼蟲滯育的解釋，Rogers]等[35]人認(rèn)為，-12℃的氣溫不會影響鼻腔內(nèi)的溫度而使羊鼻蠅幼蟲滯育，以I期幼蟲為越冬蟲態(tài)的現(xiàn)象可能是由于溫度或(和)光周期對蛹期的幼稚成蟲或羽化出的成蟲的影響，誘使這些成蟲產(chǎn)生能夠停止或延遲發(fā)育的幼蟲。在許多溫暖地區(qū)，如印度[16]、津巴布韋[9] 以及

43、非洲的一些國家[2]和法國西南部[12]冬季氣候溫暖，幼蟲不發(fā)生滯育，說明滯育現(xiàn)象與季節(jié)溫度有關(guān)。</p><p>　　1.1.4免疫學(xué)診斷</p><p>　　隨著免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們也開展了一些羊狂蠅蛆病免疫學(xué)方面的研究工作，但多偏重于診斷。如Deconinck等[36] 用Ⅱ期幼蟲做粗抗原，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定感染羊抗體水平，發(fā)現(xiàn)陽性率為88%，與剖檢調(diào)查所得感

44、染率96%相接近，從而確定酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的有效性。Duranton等[37]通過比較得出斑點(diǎn)酶聯(lián)(Dot-ELISA)快速診斷羊狂蠅蛆病的效果沒有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)準(zhǔn)確率高。</p><p>　　在抗原的免疫原性的比較上，Jagannath等[25]研究認(rèn)為，在使用Ⅱ、Ⅲ期幼蟲做抗原進(jìn)行間接血凝 (IHA)和皮膚變態(tài)反應(yīng) (ID)的羊狂蠅蛆病檢測時(shí)，IHA效果較ID敏感，Ⅱ期幼蟲抗原性比Ⅲ期幼蟲好[25]。Gar

45、fias等[38]還用雙向免疫擴(kuò)散 (DD)和IHA方法研究了羊狂蠅幼蟲抗原與羊胃腸道線蟲的交叉免疫反應(yīng)。</p><p>　　Marchenko等[39]還通過用ELISA法測定了宿主抗羊鼻蠅蛆特異性抗體動(dòng)力學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)抗體水平與幼蟲齡期、寄生數(shù)量，以及宿主的年齡密切相關(guān)。</p><p><b>　　1.1.5病理學(xué)</b></p><p&g

46、t;　　羊狂蠅是一種重要的寄生性蠅類，其最主要宿主是綿羊，寄生部位通常為羊的鼻腔、額竇等部位[2]，偶而也可移行侵入氣管和肺[8]，甚至達(dá)腦[22]。引起的主要病理變化有竇黏膜水腫、壞死，鼻卡他，鼻竇蓄膿，鼻軟骨變形，以及鼻黏膜受刺激后的打噴嚏、呼吸粗厲等慢性鼻炎的癥狀。偶而感染人后多為眼蠅蛆病，主要癥狀是流淚、有異物感，懼光，可導(dǎo)致角膜混濁、結(jié)膜炎，甚至失明[2、40]，但蟲體通常不能正常發(fā)育[41]。</p><

47、p>　　1.1.6危害及臨床癥狀</p><p>　　羊鼻蠅蛆成蟲在襲擊羊群產(chǎn)幼蟲（蛆）時(shí)，會造成羊只的恐慌，騷動(dòng)不安，互相擁擠。導(dǎo)致其頻頻甩頭或鼻孔緊帖于地面，嚴(yán)重影響羊只的采食及休息，也容易對羊只造成外在傷害。當(dāng)幼蟲在鼻腔內(nèi)固著或移動(dòng)時(shí)，以口前鉤和體表小刺機(jī)械地刺激和損傷鼻黏膜，引起鼻腔黏膜和額竇黏膜發(fā)炎和腫脹[1]。初期患羊鼻腔受到刺激，產(chǎn)生大量清鼻液，后由于病情惡化及繼發(fā)細(xì)菌感染導(dǎo)致產(chǎn)生大量粘稠的，

48、甚至膿樣鼻液，更嚴(yán)重的會有帶血鼻液流出。大量鼻液干涸后，在鼻腔及鼻孔周圍形成鼻痂，導(dǎo)致羊只呼吸困難?；佳虮憩F(xiàn)為打噴嚏，甩鼻子，搖頭，磨牙，磨鼻，流淚，眼瞼浮腫，食欲減退，日漸消瘦[1]。數(shù)月后癥狀逐漸減輕，幼蟲在鼻腔深處穩(wěn)定生長發(fā)育，當(dāng)發(fā)育為三期幼蟲時(shí)，蟲體變硬，增大，且開始向鼻腔淺部移行，因此，癥狀又有所加劇。當(dāng)個(gè)別幼蟲進(jìn)入顱腔，損傷腦膜或因鼻竇發(fā)炎波及腦膜時(shí)，會引起神經(jīng)癥狀，病羊表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)失調(diào)，旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，頭彎向一側(cè)或發(fā)生麻痹，即所謂

49、的“假性回旋癥”[1]。最后，病羊因食欲廢絕，衰竭而死亡。</p><p>　　羊狂蠅幼蟲偶爾侵害人體或其他動(dòng)物，以眼部多為見，雌蠅有在陽光較強(qiáng)的白天急速而突然飛向人或其他哺乳動(dòng)物的眼角、口部等處,產(chǎn)下幼蟲并隨即迅速飛走的習(xí)性。因人的眼角膜反光較其它部位強(qiáng),成蠅趨光而飛向眼睛部位,當(dāng)碰撞時(shí)即將幼蟲產(chǎn)于眼中,由于幼蟲活動(dòng)與結(jié)膜接觸后,幼蟲即用口鉤、尾鉤、棘刺固著于眼組織,對眼瞼及結(jié)膜產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激,若侵入眼球,可致眼

50、球破壞而失明。由羊狂蠅幼蟲所致的眼蠅蛆病在我國已報(bào)道540余例[42]。羊狂蠅幼蟲侵害人體其他部位較少見，致鼻咽部蠅蛆病更為罕見，我國1958年來共報(bào)道10余例[43～45]。多發(fā)生在牧區(qū)6～9月份,男性和女性相比是2: 1,年齡分布在5～44歲之間,職業(yè)一般是農(nóng)民、學(xué)生、戰(zhàn)士。感染者多發(fā)生在一側(cè)眼睛,取出的蟲體多者40余條,少者2條,平均10多條[46]。</p><p>　　1.1.7羊鼻蠅蛆病的防治<

51、/p><p>　　根據(jù)羊狂蠅蛆的寄生規(guī)律，大多學(xué)者統(tǒng)一認(rèn)為在成蟲產(chǎn)幼蟲的高峰期對該病實(shí)施防治措施[9、12、47]。但如何解決后續(xù)感染并打斷這種寄生蟲的生活史循環(huán)，尚無有效的措施。對成蟲的防治要遵循，炎熱的夏季堅(jiān)持早晚放牧，夏季成蟲飛翔產(chǎn)幼蟲時(shí)要避免中午放牧，中午應(yīng)將羊留在舍內(nèi)盡可能避開成蟲的侵襲[12]。</p><p>　　夏秋季不光是牧區(qū)的居民、學(xué)生,以及外出或去山林活動(dòng)的人們,應(yīng)特別注

52、意眼的衛(wèi)生和防護(hù),避免成蠅的碰撞。一旦發(fā)生眼被飛蠅的撞擊,出現(xiàn)異物感、刺痛、流淚和紅腫等癥狀,應(yīng)及時(shí)到醫(yī)院眼科,及時(shí)徹底清除眼內(nèi)幼蟲,沖洗、消炎,以免造成眼睛的進(jìn)一步損傷。對于本病醫(yī)治的越早越好,應(yīng)引起臨床上的高度重視。</p><p>　　對羊狂蠅蛆病的防治有一定難度，目前既無有效地免疫制劑，也不可能人為驅(qū)趕，唯一可行的方法是定期進(jìn)行藥物驅(qū)蟲，以防患于未然[48]。通常采用化學(xué)藥物，來消滅鼻腔內(nèi)Ⅰ期幼蟲，可將3

53、%來蘇兒溶液噴入鼻腔內(nèi)，效果甚佳[49]。許多國家包括前蘇聯(lián)是使用80%敵敵畏乳油熏蒸的方法[50～51]。為防治成蠅產(chǎn)幼蟲，也可在羊只鼻腔周圍及鼻部涂抹敵敵畏軟膏[52]。我國許多地區(qū)在成蠅侵襲高峰期通過使用有機(jī)磷類藥物來醫(yī)治病羊，收到一定效果，但安全系數(shù)不高，用藥繁瑣，熏蒸時(shí)藥物不能有效迅速到達(dá)鼻腔以及額竇、角竇等部位而使蟲體得以逃生是這類藥物的不足之處[53]。近年來，國內(nèi)外使用的廣譜抗生素類藥物(伊維菌素、阿維菌素等)治療羊鼻蠅

54、蛆病，效果較好；該抗生素可驅(qū)殺所有各部位各期幼蟲，且毒副作用小[54～55]。</p><p>　　另外，人們也在尋找化學(xué)藥物以外的防制措施，如Kal'vish[56]研究了對昆蟲致病真菌的生理學(xué)特征。他發(fā)現(xiàn)有些真菌的孢子懸液對羊狂蠅成蠅的致死率可達(dá)100%，這無疑提示人們用微生物對羊鼻蠅進(jìn)行生物防治可能是一條新的防制途徑。薄新文等[57]還深入研究了羊鼻蠅蛆的趨性和生物鐘，以求尋找利用趨性進(jìn)行生物防治的

55、可能。他們發(fā)現(xiàn)成蟲有一定的趨溫性、趨光性、趨觸性；幼蟲為負(fù)趨光性，成蟲為正趨光性；成蠅多趨短波長光且雄性略弱于雌性。生物鐘表現(xiàn)為晝出型。</p><p><b>　　1.2鼻腔免疫部分</b></p><p>　　鼻腔是上呼吸道的主要門戶，鼻腔黏膜結(jié)構(gòu)和免疫功能同整個(gè)呼吸道以及全身免疫保護(hù)密切相關(guān)。通過鼻內(nèi)免疫可產(chǎn)生對多種細(xì)菌和病毒等黏膜致病原侵襲的保護(hù)。鼻黏膜相關(guān)淋

56、巴組織在局部黏膜免疫和全身系統(tǒng)免疫起著重要作用。由于共同黏膜免疫系統(tǒng)的存在，鼻黏膜免疫可在遠(yuǎn)距離黏膜部位產(chǎn)生免疫反應(yīng)。對動(dòng)物和人體的研究表明，當(dāng)病原體刺激鼻腔時(shí)，可激發(fā)鼻內(nèi)免疫產(chǎn)生有效的抗多種病原體的免疫保護(hù)[58]</p><p>　　1.2.1鼻腔組織學(xué)特點(diǎn)</p><p>　　鼻腔內(nèi)面襯以黏膜，稱鼻黏膜。鼻黏膜緊密地附著于骨和軟骨上，鼻黏膜毛細(xì)血管豐富[59]。鼻黏膜由上皮和固有層組

57、成，上皮為假復(fù)層柱狀纖毛上皮，基膜較厚，有多種細(xì)胞如纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、基細(xì)胞、刷細(xì)胞等，固有層中含有豐富的血管和神經(jīng)以及腺體，還有多種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞等[60]。鼻黏膜呼吸部和嗅部黏膜固有層中除了有分支管泡狀的鼻腺（混合腺），還分布著大量淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞在有些部位密集形成淋巴小結(jié)，其中含有許多淋巴濾泡和毛細(xì)血管后微靜脈((high epithelialvenu

58、les，HEV)。鼻黏膜呼吸部和嗅部黏膜固有層淺層還有管徑較小的毛細(xì)淋巴管，而在其深層，存在較粗大的淋巴管。鼻黏膜的毛細(xì)淋巴管及淋巴管常和血管伴行，且常出現(xiàn)在腺體及其導(dǎo)管周圍。在鼻腔黏膜的淺層存在毛細(xì)淋巴管網(wǎng)，注入其深層的淋巴管叢，淋巴管的分布于各部位有所不同[61]。這些結(jié)構(gòu)有利于鼻腔對外界的病原微生物進(jìn)行免疫防御以及同機(jī)體其他免疫部位相互聯(lián)系。鼻黏膜上皮細(xì)胞表面豐富的微絨毛以及上皮下有大量毛細(xì)血管和毛細(xì)淋巴管網(wǎng)等，共同構(gòu)成鼻黏膜排泄

59、和吸收特殊物</p><p>　　1.2.2鼻腔的免疫功能</p><p>　　鼻黏膜中含有豐富的血管和黏液腺，能夠提高吸入氣體的溫度和濕度，黏液還有粘著吸入氣體中的塵埃和微生物的作用。鼻腔內(nèi)表面覆蓋著特殊的上皮，分別有清除塵埃、分泌粘液、吸收或感覺功能。鼻黏膜中的各類細(xì)胞執(zhí)行各自特殊功能，其中肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞與I型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)；嗜酸性粒細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化性，能吞噬病原體復(fù)合物，它的

60、胞質(zhì)內(nèi)充滿嗜酸性顆粒，顆粒內(nèi)有特殊的芳香基硫酸酶和過氧化物酶，具有對抗I型變態(tài)反應(yīng)和抗寄生蟲等作用；巨噬細(xì)胞有吞噬及捕捉、加工、貯存抗原和向淋巴細(xì)胞遞呈抗原以引起免疫應(yīng)答的作用；中性粒細(xì)胞內(nèi)的顆粒含有溶酶體，細(xì)胞在吞噬和處理抗原抗體復(fù)合物和微生物后大量死亡[62]。鼻黏膜有防御能力，鼻黏膜分泌物內(nèi)含溶菌酶、干擾素（IFN）、分泌性IgA、IgG和IgE。鼻腔黏膜下的免疫細(xì)胞是鼻腔免疫應(yīng)答的“重要力量”。這些細(xì)胞的表達(dá)的α-防御素具有廣譜

61、抗微生物活性，對細(xì)菌(革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、分枝桿菌)、真菌、放線菌、螺旋體及一些有包膜的病毒均有強(qiáng)大的殺滅作用。</p><p>　　1.2.3鼻相關(guān)淋巴組織</p><p>　　鼻腔黏膜相關(guān)淋巴組織(Nose associated lymphoid tissue，NALT)位于人和動(dòng)物呼吸道和消化道的入口處，出現(xiàn)在胚胎中在出生后迅速發(fā)育，特別是在接觸抗原后[63]。也是首先接觸吸入和

62、咽入微生物的部位，由BALT誘發(fā)的機(jī)體體液免疫應(yīng)答主要是局部分泌lgA，同時(shí)將BALT衍生的B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到遠(yuǎn)處黏膜位點(diǎn)。因此，BALT被認(rèn)為是與腸道中黏膜淋巴聚集體具有相似的功能，成為普通黏膜免疫系統(tǒng)中的重要一員。是抵御外來侵略的第一道防護(hù)線。</p><p>　　NALT表面覆蓋特異性上皮，由立方型纖毛上皮細(xì)胞、黏膜杯狀細(xì)胞構(gòu)成。于NALT上皮下固有層或黏膜下分布有數(shù)量不等的成群淋巴濾泡，這些濾泡主要由B淋巴

63、細(xì)胞和濾泡樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)組成，每個(gè)濾泡間被濾泡間區(qū)所分隔。濾泡間區(qū)主要由T淋巴細(xì)胞和相互交錯(cuò)的樹突狀細(xì)胞組合而成，并且通過HEV向血液中填補(bǔ)淋巴細(xì)胞。NALT上皮內(nèi)有一種特殊的上皮細(xì)胞為膜細(xì)胞(melnbranous cell，M細(xì)胞)，M細(xì)胞的主要功能是通過上皮屏障轉(zhuǎn)運(yùn)抗原性物質(zhì)，然后由上皮下和上皮內(nèi)的淋巴細(xì)胞激發(fā)免疫反應(yīng)或免疫耐受[64]。</p><p>　　1.2.4鼻腔

64、免疫研究進(jìn)展</p><p>　　鼻腔中生理環(huán)境溫和，是機(jī)體首先接觸大量吸入抗原(包括病毒、細(xì)胞等)的部位?？乖T導(dǎo)免疫應(yīng)答閾值低[65～66]，加上鼻腔含有豐富的NALT，NALT位于整個(gè)呼吸道免疫系統(tǒng)起始部分，在呼吸道局部免疫以及全身免疫防御中發(fā)揮著重要的作用。因此鼻黏膜是一個(gè)理想的鼻腔免疫的誘導(dǎo)位點(diǎn)[67]。哺乳動(dòng)物抗上呼吸道、胃腸道寄生蟲感染的能力與局部黏膜免疫應(yīng)答有關(guān)[68]。在誘導(dǎo)位點(diǎn)，幼稚B淋巴細(xì)胞

65、和T淋巴細(xì)胞進(jìn)行克隆選擇并與吸入的抗原接觸后增殖。B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在經(jīng)過誘導(dǎo)位點(diǎn)抗原預(yù)處理后活化，重新分布在效應(yīng)位點(diǎn)發(fā)揮免疫功能。黏膜部位致敏的免疫細(xì)胞途經(jīng)胸導(dǎo)管通過血液循環(huán)逐步分化成熟，在B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞表達(dá)的特異性歸巢受體的介導(dǎo)下，多數(shù)免疫細(xì)胞(大約80% )歸巢到抗原致敏部位(即上皮內(nèi)或誘導(dǎo)部位的黏膜固有層)發(fā)揮效應(yīng)功能，由此使黏膜免疫相對獨(dú)立于系統(tǒng)免疫，表現(xiàn)為局部性。另外，約20%的免疫細(xì)胞進(jìn)入其它的黏膜部位，發(fā)揮效

66、應(yīng)功能，使不同黏膜部位的黏膜免疫反應(yīng)相聯(lián)系[69]。</p><p>　　NALT是鼻黏膜受到外界抗原刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)的的一個(gè)效應(yīng)位點(diǎn)[70]。在NALT表面的淋巴上皮中，纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量減少，而有大量的上皮間T淋巴、B淋巴細(xì)胞和抗原遞成細(xì)胞（APC）。有報(bào)道說，其淋巴上皮中的非絨毛細(xì)胞有可改變的超微結(jié)構(gòu)并可將辣根過氧化物酶-金復(fù)合物顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)過上皮，但還需進(jìn)一步試驗(yàn)證明這些細(xì)胞為M細(xì)胞 [

67、71]。鼻黏膜的淋巴引流方向是先至鎖骨淺表淋巴結(jié)，而后至鎖骨后淋巴結(jié)，而NALT的淋巴則引流至鎖骨后淋巴結(jié)[72]。NALT是上呼吸道中唯一結(jié)構(gòu)完善的黏膜相關(guān)淋巴組織，NALT固有層中漿細(xì)胞在黏膜免疫系統(tǒng)應(yīng)答中，無論是通過黏膜抗原刺激后形成的抗體分泌細(xì)胞（ASC）數(shù)量還是免疫球蛋白分泌的水平都明顯高于全身體液免疫應(yīng)答[73]。 NALT的作用機(jī)制與腸黏膜相關(guān)淋巴組織（GALT）相似,它可有效激發(fā)黏膜和系統(tǒng)的免疫應(yīng)答。 但與其它黏膜相關(guān)淋

68、巴組織（MALT）的不同在于NALT介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不僅對鼻內(nèi)進(jìn)入的抗原產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答，還能在其它黏膜處誘導(dǎo)產(chǎn)生針對同一種抗原的強(qiáng)烈的黏膜免疫反應(yīng)。原因被認(rèn)為是：首先，鼻咽腔有著豐富的血管及淋巴組織，且不像胃腸道含有大</p><p>　　黏膜免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要特點(diǎn)就是產(chǎn)生分泌性lgA（slgA），slgA產(chǎn)量明顯高于其他免疫系統(tǒng)。IgA的合成速率高，又能透過黏膜上皮，鼻腔鼻黏膜固有層內(nèi)的淋巴細(xì)胞主要為B淋巴細(xì)胞

69、，大部分都有合成IgA的潛能，是slgA產(chǎn)生的主要部位。IgA的分泌受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。IFN-γ和腫瘤壞死因子（TNF）等對IgA的分泌有下調(diào)作用，Th1細(xì)胞分泌的IL-2[79]及Th2細(xì)胞分泌的 IL-4, IL-6,IL-5和IL-10等，對IgA的表達(dá)起增強(qiáng)和誘導(dǎo)作用，Th2型細(xì)胞因子能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞同型轉(zhuǎn)換，刺激IgA， IgG2b，IgG1，IgE的生成[80]。分泌這些因子的細(xì)胞主要分布在整個(gè)固有層，與IgA ASC

70、有著密切的空間關(guān)系。在反芻動(dòng)物中，IgA是黏膜免疫反應(yīng)的主要免疫球蛋白，起著分泌型免疫球蛋白的作用。IgA有單體、雙體和多聚體之分，血清中以7s的單體即血清型IgA為主，分泌液中以11s的雙體即分泌型IgA為主。IgA單體與連接鏈（J鏈）由黏膜固有層中的漿細(xì)胞分泌，由J鏈連接的兩個(gè)IgA單體再與黏膜上皮細(xì)胞合成的分泌片（SC）結(jié)合成分泌性IgA。slgA具有以下功能:第一，免疫排除</p><p>　　1.3 本

71、課題研究的目的和意義</p><p>　　目前，羊鼻蠅蛆病在寄生蟲學(xué)方面研究比較多，而在蟲體寄生部位及相關(guān)組織的病理學(xué)方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)在對山西黃土高原地區(qū)羊鼻蠅蛆病流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，對感染羊的鼻腔黏膜等組織進(jìn)行了病理學(xué)研究，以為該病的防治提供病理學(xué)依據(jù)。</p><p>　　鼻黏膜免疫的研究已成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,但國內(nèi)對羊狂蠅蛆感染綿羊刺激其鼻腔發(fā)生免疫應(yīng)答的相關(guān)報(bào)道很少。

72、鼻腔黏膜免疫各組成成分細(xì)胞分離純化過程較復(fù)雜影響了鼻腔黏膜免疫研究的廣泛開展,本文對黏膜免疫應(yīng)答中淋巴細(xì)胞及抗體進(jìn)行檢測，來探討羊狂蠅蛆感染綿羊后鼻腔黏膜及其局部相關(guān)組織在免疫應(yīng)答中部分免疫指標(biāo)的變化及其相互關(guān)系，為該病的防治提供免疫學(xué)基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2實(shí)驗(yàn)研究</b></p><p>　　2.1實(shí)驗(yàn)一 山西黃土高原地區(qū)羊鼻蠅蛆病流行病學(xué)調(diào)查及病理

73、組織學(xué)觀察</p><p><b>　　2.1.1材料</b></p><p>　　2.1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 </p><p>　　山西黃土高原地區(qū)的綿羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，分春季和秋季進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，并對不同年齡、不同性別共計(jì)307例綿羊進(jìn)行羊頭剖檢，主要檢查羊鼻蠅蛆病的各齡幼蟲感染情況及病理變化等。</p><p>　　2

74、.1.1.2儀器 </p><p>　　電熱恒溫水浴鍋：H.H.S21.4,山西文水醫(yī)療器械廠</p><p>　　自動(dòng)雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器</p><p>　　全封閉組織脫水機(jī)：VIP-5Jr-J2型，日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會社</p><p>　　自動(dòng)組織包埋機(jī)：TEC5EME-2型，日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會社</p>

75、;<p>　　平推式切片機(jī)：CRM-440型,日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會社</p><p>　　組織標(biāo)本伸展水槽：PS-M型，日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會社</p><p>　　電熱恒溫烤片機(jī)：Slidewarmer，日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會社</p><p>　　電熱恒溫干烤箱：202-3 型，上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠</p><p>　　

76、光學(xué)顯微鏡：MODEL U-MDOB3 OLYMPUS CORPORATION</p><p>　　常規(guī)剖解器械、照相機(jī)等。</p><p>　　2.1.1.3試劑 </p><p>　　10%中性福爾馬林、各濃度乙醇、乙醇二甲苯、二甲苯、石蠟、蘇木素色精、伊紅等。</p><p>　　2.1.1.4主要溶液配制</p>&l

77、t;p>　　2.1.1.4.1 中性福爾馬林溶液配制</p><p>　　0.01M 磷酸鹽緩沖液（PBS）配制方法：稱取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌（至少20min），保存存于室溫或4℃冰箱中。

78、</p><p>　　10%中性緩沖福爾馬林：1L甲醛液(40%溶液)＋9L0.01mol/L PBS(PH=7.4)</p><p>　　2.1.1.4.2 蘇木精染液(Harris’s蘇木精染液)</p><p>　　甲液 蘇木精 0.5g</p><p>　　95%乙醇 5ml</p><p&g

79、t;　　乙液 硫酸鋁鉀 10g</p><p>　　蒸餾水 100ml</p><p>　　氧化汞 0.25g</p><p>　　冰乙酸 0.1ml</p><p>　　配制方法：(l)將蘇木精溶于95%乙醇中制成甲液；(2)溶解硫酸鋁鉀于蒸餾水中并加熱沸騰；(3)將甲液和乙液混合煮沸半min，并加入

80、氧化汞；(4)將所得液體很快在冷水中冷卻；(5)冷卻液放置過夜后，用雙層濾紙過濾，之后加入冰乙酸即可使用。</p><p>　　2.1.1.4.3 0.5%—1%鹽酸酒精配制</p><p>　　鹽酸 0.5～1ml </p><p>　　70%酒精 100ml </p><p>　　將鹽

81、酸徐徐加入酒精中，充分混合即可。</p><p>　　2.1.1.4.4 伊紅染色液配制方法</p><p>　　伊紅 0.5g </p><p>　　95%酒精 100ml</p><p>　　將伊紅加入酒精，使充分溶解，此液為飽和伊紅溶液，最好提前配制，以使伊紅充分溶解，增強(qiáng)染色力。一般時(shí)間為1～2min。

82、</p><p><b>　　2.1.2方法</b></p><p>　　2.1.2.1 臨床癥狀、流行病學(xué)調(diào)查及剖解方法</p><p>　　從春季至秋季分別隨機(jī)選取157和150只綿羊，首先進(jìn)行臨床癥狀觀察：觀察綿羊的被毛舒展情況、精神狀態(tài)、呼吸姿勢及次數(shù)、鼻腔分泌物、鼻部是否有潰爛和炎癥等情況并予以記錄，采集選取綿羊的羊頭，回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行

83、蟲體檢驗(yàn)。從鼻、額部和顱頂正中線鋸開鼻腔、額竇和顱骨，注意觀察鼻腔內(nèi)及與其相通的鼻竇內(nèi)是否有鼻蠅蛆不同期幼蟲寄生，觀察綿羊鼻黏膜，額竇黏膜等組織器官的表觀病理變化，檢查出鼻蠅蛆的羊計(jì)為確診病例。</p><p>　　2.1.2.2 病理組織學(xué)方法</p><p>　　2.1.2.2.1 病理組織切片的制作[84]</p><p>　　取材與固定 從鼻、額部和顱頂正中

84、線鋸開鼻腔、額竇和顱骨，剖開頭顱，對鼻黏膜、腦組織、淋巴結(jié)、肺進(jìn)行取樣保存，取材要全面且具有代表性，因此要選取病變顯著的區(qū)域和可疑病灶，在同一組織塊中最好包括病灶及其周圍的健康組織，并包含該組織的主要結(jié)構(gòu)部分。將所取材料按感染蟲體和未感染蟲體分開放入盛有中性福爾馬林溶液中固定24小時(shí)，以待制片。</p><p>　　沖洗（洗滌） 組織固定后，通常用流水沖洗8～12h，以洗凈固定液，停止固定作用，避免組織過度固定，

85、而影響制片效果。</p><p>　　脫水 由低濃度至高濃度，使組織中的水分逐漸脫出，而又不引起組織材料的急劇收縮。</p><p>　　脫水的過程和時(shí)間：70%酒精，1.5h→85%酒精 1.5h→95%酒精Ⅰ，1.5h→95%酒精Ⅱ，1.5h→無水酒精Ⅰ，1.5h→無水酒精Ⅱ，1.5h，脫水時(shí)間，視組織種類和組織塊大小而靈活掌握，不必恪守規(guī)定的時(shí)間。</p><p&

86、gt;　　透明 組織脫水后，通過透明劑的作用而脫去酒精使組織透明，并使石蠟易滲入組織的過程。透明的過程和時(shí)間:1：1酒精二甲苯，1.5h（可過夜）→二甲苯Ⅰ，1.5h→二甲苯Ⅱ，1.5h。</p><p>　　浸蠟 組織經(jīng)過透明作用后移入溶化的石蠟中浸漬，用石蠟取代透明劑，使石蠟充分滲入組織內(nèi)，起填充、支持作用。浸蠟過程和時(shí)間：石蠟Ⅰ，1.5h→石蠟Ⅱ，1.5h。</p><p>　　包埋

87、 器具用平皿，先用甘油將平皿涂抹內(nèi)壁，再倒入包埋蠟，其熔點(diǎn)同蠟Ⅱ，用鑷子夾取組織塊放入平皿內(nèi)擺好，再用載玻片分割開，然后放入冷水中，待冷固后取出，切成立方形小塊，周圍留大約2mm蠟邊，用火烤熱木塊底部再粘在木塊上，以待切片。</p><p>　　切片 切片時(shí)先準(zhǔn)備好毛筆、鑷子，將粘有蠟塊的木塊固定于切片機(jī)上，調(diào)節(jié)刀與蠟塊的距離，當(dāng)蠟塊與刀口接觸時(shí)，可進(jìn)行修片，當(dāng)組織切全后，調(diào)節(jié)切片厚度3μm，然后連續(xù)進(jìn)行切片。&

88、lt;/p><p>　　展片、烤片、撈片 從一條蠟帶上切取一張完整、厚薄均勻的、無刀痕的切片，放入42℃左右的溫水里，使切片充分舒展，取一載玻片放入切片下面，用鑷子尖接觸切片邊緣，使載玻片接觸切片后垂直提出水面，這樣，切片就附貼在載玻片上了。一般貼在載玻片1/3處，另一邊用玻璃筆寫上檢驗(yàn)號碼，放入烤片機(jī)調(diào)溫至37℃，4～8h烤干后即可染色。其中鼻黏膜、咽后淋巴結(jié)組織塊至少三張切片，一張備免疫組化染色，另一張備免疫組化

89、陰性對照染色，第三張備H.E染色。</p><p>　　H.E染色 此過程為細(xì)胞核被蘇木精染成紫藍(lán)色，經(jīng)1%的酒精鹽酸分化脫去胞質(zhì)等不該著色的部位，多數(shù)細(xì)胞質(zhì)及非細(xì)胞成分被伊紅染成粉紅色。基本過程如下：</p><p>　　(1) 脫蠟：將充分烘干的切片從恒溫箱中取出，依次通過二甲苯Ⅰ，5min→二甲苯Ⅱ，10min→1：1二甲苯酒精，2min→無水酒精，2min→95%酒精，2min→8

90、5%酒精，2min→70%酒精，2min→50%酒精，2min。</p><p>　　以上步驟為脫蠟過程，石蠟包埋切片染色前必須經(jīng)過這一步驟，將石蠟徹底溶解，切片才具備進(jìn)入蘇木素染色的條件。</p><p>　　(2) 染色：將經(jīng)過脫蠟的切片，移入染色液中進(jìn)行染色。依次入蘇木素染液，12min→蒸餾水洗，5min→鹽酸酒精分化，3s→自來水洗，20min，此時(shí)切片逐漸呈鮮艷藍(lán)色，這一步

91、起反藍(lán)作用，細(xì)胞核更清晰。切片經(jīng)過以下4種上升(濃度)酒精，50%酒精 ，2min→70%酒精，2min→85%酒精，2min→95%酒精，3min，為伊紅酒精染液浸染創(chuàng)造條件，最后0.5%伊紅酒精浸染，30s。</p><p>　　脫水、透明 切片依次通過95%酒精Ⅰ，5min→95%酒精Ⅱ，5min→無水酒精Ⅰ， 5min→無水酒精Ⅱ，5min→二甲苯Ⅰ，5min→二甲苯Ⅱ，10min，洗去伊紅浮色，并進(jìn)行脫

92、水、透明。</p><p>　　染色過程至此結(jié)束。蘇木素-伊紅染色結(jié)果，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈粉紅色，紅細(xì)胞橙紅色，軟骨組織深藍(lán)色。</p><p>　　封片 將已完全透明的切片從二甲苯液中取出，擦去切片以外載玻片上多余的二甲苯，用玻璃棒滴加一滴樹膠于切片一端，隨即將蓋玻片一端與樹膠接觸稍稍前推，并與載玻片成30°角，徐徐下落，將切片封蓋，加封蓋玻片之前，需在酒精燈火焰上稍加烘烤

93、，以去潮氣，然后將烘烤面朝上加蓋，擠壓蓋玻片與切片緊密貼靠后吸取多余樹膠，置于恒溫烤片機(jī)上烘烤。</p><p>　　2.1.2.2.2 病理組織切片觀察、記錄、拍照</p><p>　　HE染色切片在生物顯微鏡下做病理組織學(xué)觀察。將制作好的病理切片在顯微鏡下進(jìn)行觀察，按照低倍鏡到高倍鏡的順序。在低倍鏡下觀察，重點(diǎn)了解組織切片的全貌、層次、部位關(guān)系。高倍鏡下觀察局部結(jié)構(gòu)。觀察特征性病變并記

94、錄和拍照。</p><p>　　2.1.2.3數(shù)據(jù)處理 </p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±SD表示，采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析。</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　2.1.3.1 臨床癥狀 </p><p>　　羊鼻

95、蠅蛆病的患羊，表現(xiàn)不安，打噴嚏，時(shí)常搖頭，摔鼻摩牙，流淚，眼瞼浮腫，眼結(jié)膜蒼白、貧血，嚴(yán)重病例下頜間隙水腫。有的患羊被毛倒逆、無光澤，精神沉郁，食欲減退，日漸消瘦?；佳蛄鞒龃罅勘且?，后期變?yōu)轲ひ盒院湍撔裕踔裂员且?；干涸鼻液在鼻周圍形成結(jié)痂，造成鼻塞，引起呼吸困難。有時(shí)，當(dāng)個(gè)別幼蟲進(jìn)入顱腔損傷到腦膜或因鼻竇發(fā)炎而波及腦膜時(shí)，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，患羊表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)失調(diào)，旋轉(zhuǎn)動(dòng)動(dòng)，發(fā)生麻痹或頭彎向一側(cè)；最后病羊食欲廢絕，極度衰竭死亡（如圖1、圖2）

96、。</p><p>　　2.1.3.2 羊鼻蠅蛆的感染情況 </p><p>　　由表2可見，剖檢的307只綿羊中寄生有羊鼻蠅蛆幼蟲的共104只，平均感染率為34%；其中流鼻液癥狀綿羊的感染率顯著高于無流鼻液癥狀綿羊。</p><p>　　表2 不同臨床癥狀綿羊鼻蠅蛆感染情況</p><p>　　Table2. Prevalence of

97、Oestrus ovis in different clinical symptom of sheep</p><p>　　注：同行數(shù)據(jù)右上標(biāo)“＊”表示組間差異極顯著（P<0.01）。</p><p>　　由表3可見，剖檢的307只綿羊中鼻蠅蛆感染率成齡羊顯著高于幼齡羊。</p><p>　　表3 不同齡期綿羊羊鼻蠅蛆感染情況</p><

98、p>　　Table3. Prevalence of Oestrus ovis in different ages of sheep</p><p>　　注：同行數(shù)據(jù)右上標(biāo)“＊”表示組間差異極顯著（P<0.01）。</p><p>　　由表4可見，剖檢的307只綿羊中鼻蠅蛆感染率秋季比春季高，成年羊比幼齡羊高，其中秋季的幼齡羊比春季的高，春季和秋季的成羊感染率差異不顯著，春季的成

99、羊比幼羊感染率高，秋季的成羊和幼齡感染率差異不顯著。</p><p>　　表4 不同季節(jié)、齡期綿羊羊鼻蠅蛆感染情況</p><p>　　Table4. Prevalence of Oestrus ovis in different season and ages of sheep</p><p>　　注：同行數(shù)據(jù)右上第一個(gè)標(biāo)號是進(jìn)行行比較，同行數(shù)據(jù)右上第二個(gè)標(biāo)號是

100、進(jìn)行列比較，同行/列數(shù)據(jù)右上標(biāo)“＊”表示組間差異極顯著（P<0.01），同行/列數(shù)據(jù)右上標(biāo)“b”表示組間差異極不顯著（P﹥0.05）。</p><p>　　由表5可見，剖檢的307只綿羊中鼻蠅蛆感染率母羊和公羊差異不顯著，其中幼齡公羊和幼齡母羊感染率差異不顯著，而成年母羊比成年公羊感染率高，成年公羊比幼齡公羊感染率高，成年母羊比幼齡母羊感染率高。</p><p>　　表5 不同齡期

101、、性別綿羊羊鼻蠅蛆感染情況</p><p>　　Table5. Prevalence of Oestrus ovis in different ages and sex of sheep</p><p>　　注：同行數(shù)據(jù)右上第一個(gè)標(biāo)號是進(jìn)行行比較，同行數(shù)據(jù)右上第二個(gè)標(biāo)號是進(jìn)行列比較，同行/列數(shù)據(jù)右上標(biāo)“＊”表示組間差異極顯著（P<0.01），同行/列數(shù)據(jù)右上標(biāo)“b”表示組間差異極不顯

102、著（P﹥0.05）。</p><p>　　2.1.3.3 剖解變化 </p><p>　　患羊頭顱的剖檢，部分患羊鼻腔的淺部黏膜上附著鼻蠅蛆的Ⅰ期幼蟲，蟲體長約2～3毫米，淺黃白色，呈米粒樣。鼻腔黏膜面呈暗紅色（圖3）；部分患羊鼻腔至鼻竇部黏膜上附著鼻蠅蛆的Ⅱ期幼蟲，蟲體長約9～20毫米，接近乳白色，呈圓錐樣。鼻腔黏膜面呈灰紅色，附著較多黏液（圖4）；部分患羊鼻腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)羊鼻蠅蛆的Ⅲ期幼蟲

103、。蟲體長約25～30毫米，蟲體分節(jié)，背部有褐色帶斑。鼻黏膜呈淡紅色，出現(xiàn)淤血點(diǎn)。表面附著少量黏液（圖5）。有的患羊鼻腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)羊鼻蠅蛆的Ⅱ、Ⅲ期幼蟲混合感染?？梢姠颉ⅱ笃谟紫x共同寄生與鼻腔內(nèi)。鼻黏膜呈灰紅色，出現(xiàn)蒼白斑。表面附著大量黏液（圖6）。</p><p>　　2.1.3.4 鏡檢病變 </p><p>　　鼻黏膜：由于鼻蠅蛆寄生的數(shù)量不同，鼻黏膜的病變程度不同，病變可分為重度、中度

104、和輕度。重度：鼻黏膜彌漫性出血、淤血、水腫，大部分的上皮細(xì)胞脫落、崩解，有較多的黏液分泌，同時(shí)有較多的炎性細(xì)胞滲出。鼻黏膜的固有層也有大量的炎性細(xì)胞的滲出和增生，這些炎性細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，還有少量的中性粒細(xì)胞和酸性粒細(xì)胞。腺體細(xì)胞腫大，呈藍(lán)染，細(xì)胞核不清晰。管腔內(nèi)有紫紅色的絮片或團(tuán)塊狀分泌物（圖7）。中度：黏膜上皮還較完整，鼻黏膜局灶性出血、水腫，有少量上皮細(xì)胞發(fā)生脫落。固有層有較多炎性細(xì)胞的滲出和增生，其中以淋巴細(xì)胞和巨

105、噬細(xì)胞為主。另外可見血管的擴(kuò)張，出現(xiàn)充血（管腔內(nèi)充滿紅細(xì)胞）。毛細(xì)血管內(nèi)有較多的中性粒細(xì)胞。腺體中分泌較多的呈現(xiàn)藍(lán)染絲網(wǎng)狀黏性物質(zhì)（圖8）。輕度：黏膜較完整，黏膜面有少量黏液分泌，并有已經(jīng)脫落的上皮附著其上。黏膜下則有少量的炎性細(xì)胞的滲出和增生，其中包括淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞及較多的中性粒細(xì)胞。黏膜的血管擴(kuò)張，管中充滿中性粒細(xì)胞。腺體上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，管腔內(nèi)有較多的呈藍(lán)染的絲網(wǎng)狀黏性分泌物（圖9）。</p><p>