生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)本科畢業(yè)論文bmp在組織中的表達

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p>　　論文題目： </p><p>　　學(xué)生姓名： </p><p>　　學(xué)號： </p><p>　　專業(yè)：

2、 </p><p>　　指導(dǎo)教師： </p><p>　　學(xué) 院： </p><p>　　1 2014 年 5 月20日</p><p>　　畢業(yè)論文（設(shè)計）內(nèi)容介紹</p><p>

3、;<b>　　目錄</b></p><p><b>　　中文摘要1</b></p><p><b>　　英文摘要1</b></p><p><b>　　1 引言3</b></p><p>　　1.1研究背景目的及意義3</p><

4、;p>　　1.2 先兆子癇的概念3</p><p>　　1.3 先兆子癇病因的研究進展3</p><p>　　1.4 子宮內(nèi)膜蛻膜化的概念4</p><p>　　1.5 BMP2的概述5</p><p>　　2 實驗材料和方法6</p><p>　　2.1 實驗材料6</p><p

5、>　　2.2 試劑及儀器6</p><p>　　2.3 實驗方法6</p><p>　　2.4 實驗過程6</p><p><b>　　3 實驗結(jié)果16</b></p><p><b>　　4 討論18</b></p><p><b>　　參考文獻

6、19</b></p><p><b>　　致謝20</b></p><p>　　BMP2在組織中的表達</p><p>　　摘要：先兆子癇屬于妊高癥的一種，它是指孕婦在妊娠24周左右，在高血壓和蛋白尿的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)的頭痛、眼花、惡心、嘔吐、上腹不適等癥狀，患有先兆子癇的孕婦如果得不到及時治療，往往會出現(xiàn)一些并發(fā)癥，對母親而言會造成

7、子癇發(fā)作，對胎兒而言更為嚴重，會引起胎盤早剝、發(fā)育遲緩、宮內(nèi)死胎等。</p><p>　　先兆子癇發(fā)病率不低，也引起了人們對它的重視，盡管已經(jīng)研究多年，但這種妊娠特有疾病的病因和發(fā)病機制至今尚未完全闡明，目前認為先兆子癇是由于胎盤發(fā)育異常引起，而胎盤的發(fā)育與子宮內(nèi)膜蛻膜化有密切的關(guān)系，在子宮內(nèi)膜的正常蛻膜化過程中BMP2發(fā)揮重要的作用。因此猜想，先兆子癇可能與BMP2的異常表達直接相關(guān)。</p>&

8、lt;p>　　關(guān)鍵詞：先兆子癇；蛻膜化；BMP2</p><p>　　The Expression of BMP2 in Endometrium Decidual</p><p>　　Abstract: Preeclampsia (PE) is one of pregnancy hypertension. It refers to the pregnant women who app

9、ear have a headache, giddy, disgusting, vomiting, epigatic discomfort and other symptoms on the basis of high blood pressure and proteinuria 24 week after pregnancy. If the woman who has Preeclmapsis left untreated will

10、get some complications, for the mother, it can cause eclampsia attack, more serious for fetus, it can cause placental abruption, retardation, intrauterine demise and so on.</p><p>　　The incidence of PE is no

11、t low, so it has aroused people’s attention. Although people has studied it for years, the endemic disease etiology and pathogenesis has not been fully clarify. Now most people think preeclampsia is caused by abnormal pl

12、acenta, and the development of placenta has a close relationship with endometrial decidualization, in the normal process of endometrial decidualization BMP 2 play an important role. So I guess the preeclampsia has a dire

13、ctly related with the abnormally ex</p><p>　　Key words: preeclmapsis；decidualization；BMP2 </p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　研究背景、目的及意義</p><p>　　先兆子癇(PE )是母嬰死亡的

14、主要妊娠并發(fā)癥之一, 臨床發(fā)病率約5 %, 表現(xiàn)為高血壓蛋白尿, 并伴有頭痛、眼花、惡心、胃區(qū)疼痛及嘔吐等癥狀, 可損壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)。患有先兆子癇的孕婦如果得不到及時治療，往往會出現(xiàn)一些并發(fā)癥，對母親而言會造成子癇發(fā)作，對胎兒而言更為嚴重，會引起胎盤早剝、發(fā)育遲緩、宮內(nèi)死胎等。[1, 2, 3]</p><p>　　先兆子癇發(fā)病率不低，也引起了人們對它的重視，，盡管已經(jīng)研究多年，但這種妊娠特有疾病的病因

15、和發(fā)病機制至今尚未完全闡明，目前認為先兆子癇是由于胎盤發(fā)育異常引起，而胎盤的發(fā)育與子宮內(nèi)膜蛻膜化有密切的關(guān)系，在子宮內(nèi)膜的正常蛻膜化過程中BMP2發(fā)揮重要的作用。因此猜想，先兆子癇可能與BMP2的異常表達直接相關(guān)。 </p><p>　　通過實驗探究先兆子癇病人子宮內(nèi)膜蛻膜中BMP2表達量與正常人的是否有明顯差異，從而證明先兆子癇與BMP2的異常表達是否直接相關(guān)。</p><p>　　先兆

16、子癇的概念及并發(fā)癥</p><p>　　先兆子癇屬于妊高癥的一種，它是指孕婦在妊娠24周左右，在高血壓和蛋白尿的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)的頭痛、眼花、惡心、嘔吐、上腹不適等癥狀。</p><p>　　患有先兆子癇的孕婦如果得不到及時治療，往往會出現(xiàn)一些并發(fā)癥，對母親而言會造成子癇發(fā)作，對胎兒而言更為嚴重，會引起胎盤早剝、發(fā)育遲緩、宮內(nèi)死胎等[4]。</p><p>　　先兆子癇

17、病因的研究進展</p><p>　　先兆子癇發(fā)病率不低，也引起了人們對它的重視，，雖然已經(jīng)研究多年，但其病因和發(fā)病機制至今尚未完全闡明，關(guān)于PE 的發(fā)病機制,認為它是多因素引起的綜合征, 目前提出先兆子癇是由于胎盤發(fā)育異常引起。妊娠過程中子宮在血壓調(diào)節(jié)中起重要作用。母體血容量可增加50%，為適應(yīng)這一過程，子宮螺旋動脈發(fā)生重構(gòu)，從卷曲狹窄變寬變薄，從而減少壓力，增加胎兒的血供。先兆子癇患者發(fā)生子宮螺旋動脈重構(gòu)障礙，

18、而造成高血壓的一系列癥狀。[5]</p><p>　　1.4 子宮內(nèi)膜蛻膜化的概念及作用</p><p>　　圖一 子宮結(jié)構(gòu)圖(引自中醫(yī)世家 《組織學(xué)與胚胎學(xué)》)</p><p>　　子宮內(nèi)膜蛻膜化是指子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細胞在受到蛻膜化誘導(dǎo)因子的刺激下，增生、分化形成的一種特殊的組織，它對于妊娠的建立及維持具有至關(guān)重要的作用。月經(jīng)周期的分泌晚期，基質(zhì)細胞開始增生分化成

19、前蛻膜細胞及蛻膜組織。若受精卵著床于子宮內(nèi)膜，前蛻膜細胞在孕激素的影響下，繼續(xù)發(fā)育、增大，即可成為蛻膜細胞及妊娠蛻膜[6，7]。</p><p>　　蛻膜的特定功能也不是不清楚。一個可能就是蛻膜能控制滋養(yǎng)層侵入到母體動脈中的程度。如果這個侵入過程能正確發(fā)生,母體就不會因為胚胎侵入的太深而招致?lián)p害, 胎兒也會獲得充分的營養(yǎng)。但如果沒有蛻膜的存在, 滋養(yǎng)層就能直接侵入到子宮肌層中，侵入過程就不會被限制在肌層的內(nèi)側(cè),

20、可能會導(dǎo)致肌肉組織的破壞和子宮的破裂等。因此, 蛻膜最重要的作用很可能是作為一個屏障, 使的母體免受由于胎兒的過渡侵入帶來損害。 [8, 9]</p><p>　　1.5 BMP2的概述</p><p>　　BMP即 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein）,最早作為體內(nèi)能夠誘導(dǎo)骨與軟骨形成的因子被人認識，又被稱作“成骨素”，屬于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族

21、。BMP家族成員除了有明顯的的成骨作用外，還參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，能抑制細胞的生長、增殖，促進細胞分化和凋亡[10]。BMP2作為BMP家族的一員，可與細胞膜表面的受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的Smad信號通路，促進人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞發(fā)生蛻膜化[11]。</p><p><b>　　2 實驗材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 實驗材料</

22、b></p><p>　　試驗材料：本實驗選取正常人和患有先兆子癇的病人的子宮內(nèi)膜蛻膜組織。</p><p>　　材料來源：齊魯醫(yī)院，醫(yī)生分別在正常人和先兆子癇病人分娩后（或流產(chǎn)后）取其子宮內(nèi)膜蛻膜組織，液氮保存待用</p><p><b>　　2.2 試劑及儀器</b></p><p><b>　　試劑

23、：</b></p><p>　　1）液氮 2）裂解液 3）SDS上樣緩沖液 4）電泳緩沖液 </p><p>　　5）轉(zhuǎn)移緩沖液 6）封閉液 7）TBST 8）洗脫抗體緩沖液 </p><p>　　9）顯影液 10）定影液 11）BMP2抗體</p><p><b>　　儀器： </b>

24、;</p><p>　　垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置 2）離心機 3）移液槍及配套槍頭 </p><p>　　4）玻璃勻漿器 5）酶標儀 6）超聲波破碎儀 7）冰箱 </p><p>　　8）鑷子 9） PVDF膜 10）小塑料盆 11）冰袋 12）冰盒 </p><p>　　13）刀片 14）鉛筆 15）mar

25、ker筆 16）孵育袋 17）熱封口器</p><p>　　15 ) 脫色搖床 16）培養(yǎng)皿 17）ECL顯影儀 18）電磁爐 </p><p><b>　　2.3 實驗方法 </b></p><p>　　對所得蛋白樣品定量后，在等量的蛋白樣品中，采用 Western Blot對正常人和患有先兆子癇病人來源的子宮內(nèi)膜蛻膜組織中BMP2

26、表達量進行比較。</p><p>　　實驗中用人體組織中的一中管家基因β-actin作為內(nèi)參。</p><p><b>　　2.4 實驗過程</b></p><p><b>　　一、溶液配制</b></p><p>　?。ㄒ唬┑鞍琢呀狻⒍浚?lt;/p><p>　　1、PBS緩

27、沖液： 4℃保存。</p><p>　　NaCl 0.8015 g</p><p>　　KCl 0.0202 g</p><p>　　Na2HPO4 0.142 g</p><p>　　KH2PO4

28、 0.0239 g</p><p>　　DDW 80 ml</p><p>　　0.1M HCl/ 0.5M NaOH 調(diào)節(jié)PH7.4</p><p>　　DDW 定容至 100 ml</p><p>　　2、10m M

29、PMSF（10xPMSF）(蛋白酶抑制劑)： -20℃保存。</p><p>　　PMSF(MW174.2) 0.0174 g </p><p>　　異丙醇 10 ml</p><p><b>　?。ǘ┲颇z：</b></p><p>　　1、30

30、%丙烯酰胺溶液： 4℃避光保存。</p><p>　　丙烯酰胺（Acr） 29.2 g（29.2%）</p><p>　　甲叉雙丙烯酰胺（Bic） 0.8 g（0.8%）</p><p>　　DDW 定容至 100ml</p><p>　　37℃水浴溶解，0.45μm過濾器過濾

31、。</p><p>　　2、10% SDS溶液： 室溫保存。 </p><p>　　SDS 1.0 g</p><p>　　DDW 定容至 10 ml</p><p><b>　　37℃水浴溶解。</b></p><p&g

32、t;　　3、10%過硫酸銨（AP）： 最好現(xiàn)用現(xiàn)配 </p><p>　　過硫酸銨（AP） 0.01 g </p><p>　　DDW 定容至 100 μl</p><p>　　4、1.5 M Tris- HCl (PH 8.8）： 4℃保存。</p><p>　　Tris

33、 18.171 g</p><p>　　DDW 50 ml</p><p>　　濃HCl調(diào)節(jié) PH 8.8</p><p>　　DDW 定容至 100 ml</p><p>　　5、1.0 M Tr

34、is-HCl (PH 6.8）： 4℃保存。</p><p>　　Tris 12.114 g</p><p>　　DDW 50 ml</p><p>　　濃HCl調(diào)節(jié) PH 6.8</p><p>　　DDW 定容至

35、 100 ml</p><p>　　6、TEMED： 分裝200 μl于EP管中，4℃遮光保存。</p><p><b>　　（三）電泳：</b></p><p><b>　　1、電泳緩沖液：</b></p><p>　　（1）5x電泳緩沖液（儲存液）： 無需調(diào)PH，

36、4℃保存4周左右。</p><p>　　Tris 7.6 g(125 mM)</p><p>　　Gly（甘氨酸） 47 g(500 mM)</p><p>　　SDS 2.5 g(0.5%)</p><p>　　DDW 定容至

37、 500ml</p><p>　?。?）1x電泳緩沖液（工作液）： 常溫保存1周左右，最多共使用3次</p><p>　　5x 電泳緩沖液 200 ml </p><p>　　DDW 定容至 1000 ml </p><p>　　2、1x轉(zhuǎn)移緩沖液（工作液）

38、： 常溫保存1周左右，最多共使用3次。</p><p>　　Tris 1.5 g </p><p>　　Gly 7.2 g </p><p>　　甲醇 75 ml </p><p>　　DDW 定容至

39、 500 ml</p><p>　?。ㄋ模╋@色： </p><p>　　1、50x TBS（1 M，PH7.5）： （室溫保存） 10x TBS</p><p>　　Tris（MW121.14） 121 g 24.2 g</p><p>　

40、　DDW 800 ml 160 ml</p><p>　　濃HCl調(diào)節(jié) PH7.5 PH7.5</p><p>　　DDW 定容至 1000 ml 1000 ml</p><p&

41、gt;　　2、1x TBS-T： （室溫保存）</p><p>　　Tris 2.42 g</p><p>　　NaCl 8 g</p><p>　　Tween-20 1 ml</p><p>　　濃HCl調(diào)節(jié)

42、 PH7.5 </p><p>　　DDW 定容至 1000 ml</p><p>　　3、5%脫脂奶粉： （ 4℃保存，可于一周內(nèi)使用）</p><p>　　1XTBST 緩沖液 95-100 ml 10 ml 5 ml</p><p>　　

43、脫脂奶粉 5 g 0.5 g 0.25g</p><p><b>　　4、一抗：</b></p><p>　　兔來源BMP2一抗 、β-actin一抗</p><p><b>　　5、二抗</b></p><p><b

44、>　　羊抗兔二抗 </b></p><p><b>　　二、蛋白樣品制備</b></p><p>　　1. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM。（如：取約40 mg組織，加入450 μl裂解液，加50 μl 10x PMSF） </p><p&g

45、t;　　2. 取四只EP管，分別標記為N1，N2，PE1,PE2。分別把兩位正常人和兩位先兆子癇病人蛻膜組織剪切成細小的碎片，按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。 </p><p>　　3. 用玻璃勻漿器勻漿(置于冰上)，使其充分裂解，分別放入對應(yīng)的EP管中。</p><p>　　4. 用超聲波破碎儀對所得的子宮內(nèi)膜蛻膜組織進一步破碎。 </p>

46、<p>　　5. 充分裂解后，4℃ 12000 rpm離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE 、Western和免疫沉淀等操作。 </p><p>　　三、蛋白樣品濃度測定及上樣體積的確定</p><p>　　使用“BCA蛋白濃度測定試劑盒”</p><p>　　1.取0.8 ml蛋白標準配制液加入到一管蛋白標準(20 mg BSA)中，充分溶解后

47、配制成25 mg/ml的蛋白標準溶液。</p><p>　　2.取適量25mg/ml 蛋白標準，稀釋至終濃度為0.5 mg/ml。例如取20 μl 25mg/ml 蛋白標準，加入980 μl PBS即可配制成0.5 mg/ml蛋白標準。蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標準品。稀釋后的0.5 mg/ml蛋白標準也可以-20℃長期保存。 </

48、p><p>　　3.根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。 </p><p>　　4.將標準品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 μl加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20 μl。 </p><p>　　5.加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標

49、準品稀釋液到20 μl 。 </p><p>　　6.各孔加入200 μl BCA 工作液，37℃放置20-30分鐘。 </p><p>　　7.測定A562，540-595 nm之間的波長也可接受。</p><p><b>　　表一</b></p><p>　　繪制標準曲線。如圖二：</p><p&

50、gt;　　圖二 蛋白濃度標準曲線</p><p><b>　　表二</b></p><p>　　8.根據(jù)標準曲線分別計算出樣品N1、N2、PE1、PE2的蛋白濃度。 </p><p>　　經(jīng)過測定可得蛋白樣品N1、N2、PE1、PE2的濃度分別為2.619 μg/μl,3.289 μg/μl,3.906 μg/μl,2.398 μg/μl<

51、;/p><p>　　為使各蛋白樣品上樣量相等，算得上樣體積為</p><p><b>　　表三</b></p><p>　　β-actin（蛋白總量20 μg）</p><p><b>　　表四</b></p><p>　　BMP2(蛋白總量40μg)</p>&l

52、t;p>　　四、SDS-PAGE制膠配方</p><p>　　(一) 10%分離膠</p><p>　　DDW 2.0 ml</p><p>　　30%丙烯酰胺 1.65 ml</p><p>　　1.5MTris(PH6.8) 1.

53、25 ml</p><p>　　10%SDS 50 μl</p><p>　　10%AP 50 μl</p><p>　　TEMED 2 μl </p><p>　　總量

54、 5 ml</p><p>　　（二）5%濃縮膠 </p><p>　　DDW 1.05 ml</p><p>　　30%丙烯酰胺 250 μl</p><p>　　1.0M Tris(PH6.8) 190 μl</p>

55、<p>　　10%SDS 15 μl</p><p>　　10%AP 15 μl （AP:0.01 g; DDW:100μl） TEMED 1.5 μl</p><p>　　總量 1.5

56、ml</p><p><b>　　五、制膠、電泳</b></p><p><b>　?。ㄒ唬┓蛛x膠：</b></p><p>　　1.將制膠槽安裝好。</p><p>　　2.依照上面PAGE制膠配方按分離膠所需各試劑的濃度和體積，配制相應(yīng)體積的溶液，加入TEMED后，立即灌膠。（用1毫升的槍在膠板

57、的一側(cè)緩慢灌入。）</p><p>　　3.灌裝分離膠后，用DDW將凝膠板上部空隙灌滿。（用200 μl的槍左右來回灌入，操作要輕柔緩慢。）</p><p>　　4.靜止30 min。</p><p><b>　?。ǘ饪s膠：</b></p><p>　　1.依照上面PAGE制膠配方配制所需體積的濃縮膠溶液。</

58、p><p>　　2.待分離膠充分聚合后，將其上部的DDW倒掉，并用濾紙吸干水分。</p><p>　　3.向濃縮膠溶液中，加入TENMED后，立即灌膠，并迅速插好梳子。</p><p>　　4.靜止一小時以上。</p><p>　　5.待膠全部凝好后，依次將制膠槽的左右固定把手松開，將制膠架卸下。</p><p><

59、b>　?。ㄈ┘訕樱?lt;/b></p><p>　　1.電泳前，將預(yù)先定量、變性的所需蛋白樣品從冰箱取出，加入所需體積的上樣緩沖液，10,000 rpm離心5 min，沸水中煮7 min（使蛋白完全變性）,10,000 rpm離心，2 min去氣泡。</p><p>　　2.拔梳子：輕柔.垂直地將梳子從凝膠板中拔出，并用DDW輕柔清洗加樣孔，之后甩干水分。</p>

60、;<p>　　3.沖洗加樣孔：將已經(jīng)拔出梳子的制膠架放置于電泳槽內(nèi)，將兩塊凝膠板之間小腔充滿電泳緩沖液，并令其溢出部分緩沖液流入電泳槽中。</p><p>　　4.加樣：將蛋白樣品N1、N2、PE1、PE2及蛋白Marker按順序依次放于試管架上，以此吸取Marker、N1、N2、PE1、PE2（β-actin） 及Marker、N1、N2、PE1、PE2（BMP2）所需樣品體積，緩慢并連續(xù)將蛋白樣

61、品加入到加樣孔中。</p><p><b>　　（四）電泳：恒壓</b></p><p>　　1.加完最后一個樣品后，快速將電泳槽蓋蓋上，打開電源，設(shè)定80 V。（電泳開始前，檢查電源、電泳槽之間的正負極連接線是否正確）</p><p>　　2. 30 min后，樣品開始進入分離膠，此時應(yīng)改變恒流為120 V，并將電泳槽放入盛有冷水的小盆中，整

62、個電泳過程中，應(yīng)保持在10℃左右。</p><p>　　3．根據(jù)需要停止電泳。一般情況下，在所需濃度的SDS-PAGE電泳時，以溴酚藍尚未跑出凝膠為準。</p><p><b>　　轉(zhuǎn)膜、染色：</b></p><p><b>　?。ㄒ唬蕚淠ぃ?lt;/b></p><p>　　1.剪膜：根據(jù)樣品孔的多

63、少和膠的高度裁剪適當大小的PVDF膜。</p><p>　　2.膜活化：將膜浸入盛有<10 ml甲醇的干凈玻璃培養(yǎng)皿中，輕輕涮一下（5秒） </p><p>　　3.清洗：將膜在盛有DDW的干凈玻璃培養(yǎng)皿中清洗，約2 min。</p><p>　　4.在這期間，準備一專用小塑料盆，將約400 ml預(yù)冷轉(zhuǎn)移緩沖液倒入小盆中。</p><p

64、>　　5.膜滲透：將清洗后的PVDF膜放入緩沖液中，靜等15 min以上。</p><p>　　6.膠滲透：此時，電泳完畢，卸下電泳槽，用長解剖刀片從中間打開玻璃板，令凝膠位于其中一塊玻璃板上，根據(jù)需要大小切膠，將需要轉(zhuǎn)移部分放入上述盛有轉(zhuǎn)移緩沖液的小盆中，與PVDF膜一同靜置15 min。</p><p>　?。ǘ┠まD(zhuǎn)移 恒流</p><p>　　1

65、.依次將（+極）海綿---濾紙---膜---膠---濾紙---海綿 （-極）在轉(zhuǎn)移緩沖液中放置好后，各層之間不要有氣泡。用2B鉛筆在按照預(yù)染蛋白Marker的位置，在膜上標記好后。依次放好濾紙、海綿，并將轉(zhuǎn)移夾扣緊，放入轉(zhuǎn)移槽中，裝滿預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液（注意：緩沖液面要略高于轉(zhuǎn)移夾的高度）；</p><p>　　2.確認好需要將蛋白向PVDF膜轉(zhuǎn)移的方向和電源正負極后，將電流設(shè)定在120 mA后，開始轉(zhuǎn)移。由于BM

66、P2蛋白大小為45 kDa,因此轉(zhuǎn)移時間定為50 min。</p><p><b>　?。ㄈ┟庖邫z測：</b></p><p>　　1.PVDF膜封閉：5%脫脂奶粉封閉1.5 h。</p><p><b>　　2.一抗孵育：</b></p><p>　　(1)根據(jù)不同抗體所需濃度及反應(yīng)液成分，配制

67、一抗，經(jīng)摸索本次試驗BMP2一抗?jié)舛葹?:2000（2 μl一抗，2.5 ml 2.5%脫脂奶粉），β-actin一抗?jié)舛葹?:5000（0.5 μl一抗，2.5 ml 2.5%脫脂奶粉）。</p><p>　　(2)將一抗工作液加入到孵育袋中，再將封閉完的膜放入袋中，封口。4℃過夜。</p><p>　　3.第二天早上，將膜從4℃冰箱拿出，平衡0.5 h。 </p>

68、<p>　　4.洗膜：將膜移入盛有15 ml的TBS-T培養(yǎng)皿中，至于脫色搖床上，洗4次，每次15 min。（對于內(nèi)參β-actin,無需進行二抗處理，可繼續(xù)放置于4℃，待測目的蛋白膜二抗反應(yīng)后，一同清洗）。</p><p>　　5.二抗孵育：在最后一次洗膜完畢前，準備濃度為1:5000（0.5 μl一抗，2.5 ml 2.5%脫脂奶粉）。的二抗反應(yīng)液。洗膜完畢后，孵育1 h。</p>&

69、lt;p>　　6.洗膜：反應(yīng)完畢后，將膜移入盛有15 ml的TBS-T培養(yǎng)皿中，輕搖清洗，洗4次，每次15 min。</p><p><b>　　7.ECL反應(yīng)：</b></p><p>　　(1)洗膜期間，將試驗臺面擦拭干凈后，鋪上干凈的保鮮膜。</p><p>　　(2)最后一次洗膜完成前，準備ECL反應(yīng)液。將ECL試劑瓶拿出4℃，根

70、據(jù)PDVF膜的大小，分別抽取等量（200至500 μl）的A液和B液，移入到1.5 ml離心管中，充分混勻。（100 μlECL反應(yīng)液/cm2膜）</p><p>　　(3)用專用的平頭鑷子，將清洗后的膜從TBS-T中拿出，用濾紙吸去膜上的水分，將轉(zhuǎn)有蛋白的膜面向上，放置到保鮮膜上。</p><p>　　(4)將混勻的ECL反應(yīng)液，快速滴在膜上，避光，室溫孵育5 min。</p>

71、;<p>　　(5)將反應(yīng)完畢的膜，用鑷子拿起，放到濾紙上，吸干水分。</p><p>　　(6)將有蛋白的膜面向下（排出氣泡），用保鮮膜將膜包裹起來，然后，正面向上，迅速放入X-光片壓片夾中，扣緊后，拿入暗室。</p><p><b>　　8.曝光及顯影：</b></p><p>　　(1)在洗膜期間（顯影前10分鐘），應(yīng)將X光

72、片以及顯影、停影以及定影液，在暗室中準備好。</p><p>　　(2)在暗室中（開有紅燈），打開壓片夾。根據(jù)膜的大小，剪裁略大于膜的X光片，剪切左上角后，整齊放在膜上，壓緊壓片夾，收起、包好X光膠片盒（此時要注意觀察PVDF膜上是否有熒光出現(xiàn)）</p><p>　　(3)定時:應(yīng)根據(jù)PVDF膜上熒光的強度，設(shè)定曝光時間。（如：β-actin曝光30 s）</p><p

73、><b>　　實驗結(jié)果</b></p><p>　　對兩個正常人和兩個先兆子癇病人子宮內(nèi)膜蛻膜組織進行蛋白定量后，通過Western Blot顯影得到其內(nèi)參β-actin的表達情況，各樣本中β-actin的表達量基本一致，因此本次試驗結(jié)果可用，如圖三所示。</p><p>　　圖三 從左至右依次為N1、N2、PE1、PE2子宮內(nèi)膜蛻膜組織中β-actin表達情

74、況</p><p>　　通過Western Blot顯影得到BMP2的表達情況，,可看出PE1病人蛻膜組織中BMP2的相對表達量最少;而正常人N1與先兆子癇病人PE2兩位蛻膜組織中BMP2的表達量相近，而正常人N2的蛻膜組織中BMP2的表達含量最高。以上四組數(shù)據(jù)中，兩位正常人的BMP2的蛋白表的量相差就非常大，兩位病人的BMP2蛋白表達量也無法看出與正常人之間有明顯異常，此結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不符。如圖四、圖五所示。&

75、lt;/p><p>　　圖四 從左至右依次為N1、N2、PE1、PE2子宮內(nèi)膜蛻膜組織中BMP2表達情況</p><p>　　圖五 從左至右依次為N1、N2、PE1、PE2子宮內(nèi)膜蛻膜組織中蛋白表達情況</p><p><b>　　4討論</b></p><p>　　進過分析，出現(xiàn)這種情況的原因可能有以下幾種情況：<

76、;/p><p>　　正如我們所知道的，人體是一個高度協(xié)調(diào)、精細調(diào)控的一個整體，先兆子癇的發(fā)病可能不只是有一個關(guān)鍵基因的表達異常。</p><p>　　可能是由于每個個體中BMP2基因表達的差異。</p><p>　　驗證基因的表達量的方法不能只在蛋白水平，還可應(yīng)該mRNA水平進行。</p><p>　　實驗數(shù)據(jù)樣本量較少。 </p>

77、<p>　　一個疾病病因的診斷應(yīng)該經(jīng)過反復(fù)試驗驗證，但由于時間有限并且實驗材料的來源為人體，材料得來實在不易，因此我只是進行了簡單操作，實驗數(shù)據(jù)樣本量較少。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　1張克榮, 邢福祺. 先兆子癇發(fā)病機制研究進展[J]. 國外醫(yī)學(xué): 婦產(chǎn)科學(xué)分冊, 2003,30(3): 142-144.</

78、p><p>　　2 Jose Antonio GE, Maria J, et al. HELLP syndrome. Med Clin (Barc), 2002, 118(5):197-199 </p><p>　　3 Balderas-Pena L M, Canales-Muñoz J L, Angulo-Vázquez J, et al. [The HELPP synd

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82、 C Y, Bagchi I C, Taylor R N, et al. Endometrial decidualization: of mice and men[C]//Seminars in reproductive medicine. NIH Public Access, 2010, 28(1): 17.</p><p>　　10王志勇, 余濟春. BMP-2 的研究現(xiàn)狀[J]. 實用臨床醫(yī)學(xué), 2009,

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