交枝頂孢霉與枝狀枝孢霉的殺螨（蟲）活性及其遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、蟲生真菌以其寄主廣泛，不易產(chǎn)生抗性，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)成為國(guó)內(nèi)外生物防治研究的熱點(diǎn)。我國(guó)蟲生真菌資源豐富，但是能夠防治葉螨的病原真菌報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)室從田間采集的柑橘全爪螨Panonychus citri（McGregor）螨尸上分離到2株病原真菌，分別鑒定為交枝頂孢霉Sarocladium implicatum CQBBW8（簡(jiǎn)稱CQBBW8）與枝狀枝孢霉Cladosporium cladosporioides CQBBW

2、3（簡(jiǎn)稱CQBBW3）。為加強(qiáng)對(duì)這2個(gè)菌株的了解，為生物殺螨真菌制劑的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，本文對(duì)這2個(gè)菌株進(jìn)行了殺螨活性、生物學(xué)特性、殺蟲機(jī)理以及遺傳轉(zhuǎn)化等方面的研究，結(jié)果如下：
　　CQBBW8菌株殺柑橘全爪螨活性較好，LC50值為1.2×106個(gè)孢子/mL，LT50值為5.1759 d，好于CQBBW3菌株的LC50值4.66×108個(gè)孢子/mL和LT50值6.2353 d。生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，CQBBW8菌株在PDA培養(yǎng)基上菌

3、絲生長(zhǎng)最快，在SEA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大；而CQBBW3菌株在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，在查氏培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最大。2個(gè)菌株均在以甘露醇為碳源、蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，最適生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)溫度為25℃，CQBBW8菌株的最適產(chǎn)孢溫度為30℃，而CQBBW3菌株的最適產(chǎn)孢的溫度為15℃；2個(gè)株菌均在pH為6.0～8.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢較好，分生孢子在強(qiáng)酸性環(huán)境下萌發(fā)率更高；紫外線對(duì)2個(gè)菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢有一定的影響，對(duì)孢子有很強(qiáng)的殺

4、傷作用。此外，2個(gè)菌株與殺菌劑氧化亞銅和5種殺螨劑的相容性均較好，在田間可以互配使用。
　　采用―浸漬法‖分別測(cè)定了CQBBW8與CQBBW3菌株對(duì)家蠶4齡幼蟲及蠶蛹的致病力，并采用福林酚試劑法和幾丁質(zhì)酶活試劑盒測(cè)定了2個(gè)菌株在蟬蛻培養(yǎng)基中胞外蛋白酶與幾丁質(zhì)酶的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CQBBW8與CQBBW3菌株對(duì)家蠶幼蟲的校正死亡率、LT50值以及對(duì)蠶蛹的LC50值分別為80.00%、4.3439 d、9.4817×108個(gè)孢子/

5、mL與69.99%、5.5697 d、1.26×1010個(gè)孢子/mL，CQBBW8菌株的殺蟲效果更好。從CQBBW8與CQBBW3菌株在蟬蛻誘導(dǎo)培養(yǎng)基中產(chǎn)胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的變化趨勢(shì)表明，蛋白酶和幾丁質(zhì)酶均增強(qiáng)表達(dá)，在降解蟬蛻的過程中二者作用順序相同，但蛋白酶起主要作用。比較分析這2個(gè)菌株蛋白酶與幾丁質(zhì)酶活性的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)CQBBW8比CQBBW3菌株分解體壁蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)的能力更強(qiáng)。
　　柑橘全爪螨被CQBBW8與CQBBW

6、3菌株分別侵染后，螨體內(nèi)的3種解毒酶活性發(fā)生了不同程度的變化，響應(yīng)順序均為：谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）、乙酰膽堿酯酶（AchE）。三種酶活均呈先上升后下降的趨勢(shì)，GSTs活性從第1 d就快速上升，CQBBW8與CQBBW3菌株侵染引起的最大酶活分別出現(xiàn)在第3、4 d，為8.13、6.53 U/mL prot；CarE活性從第2 d開始快速上升，2個(gè)菌株的侵染引起的酶活高峰也分別出現(xiàn)在第3、4 d，分別為12.

7、98、10.06 U/mL prot；Ac hE活性從第3天開始快速上升，且均在第4 d酶活性最大分別為0.1818、0.1120 U/mL prot；3種解毒酶活均在4-5 d開始快速下降，在第6、7 d接近或低于對(duì)照，說明螨體接近死亡。
　　利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）構(gòu)建CQBBW8菌株的T-DNA隨機(jī)插入突變體庫(kù)，分析

8、表型突變菌株相關(guān)基因的功能。結(jié)果顯示，遺傳轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化效率為100-200個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子，從構(gòu)建的含有2800個(gè)轉(zhuǎn)化子的突變體庫(kù)中篩選出41株表型變化較大的轉(zhuǎn)化子。采用Hi-TAIL PCR技術(shù)擴(kuò)增到9株突變子的T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，將獲得側(cè)翼序列與CQBBW8菌株的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，得到相應(yīng)基因?yàn)椋汗央霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OPT）（B11轉(zhuǎn)化子）、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子（B36轉(zhuǎn)化子）、延胡索酰乙酰乙酸（FAA）水解酶（