枝孢樣枝孢霉微生物學特性的實驗研究.pdf

1、枝孢樣枝孢霉是一種廣泛存在于環(huán)境中的暗色真菌，在一定條件下可導致人和動物的暗色絲孢霉病。迄今為止，人類不但對枝孢樣枝孢霉的基本微生物學特性及其致病情況尚缺乏了解，而且還不得不面臨著對枝孢樣枝孢霉所致暗色絲孢霉病診斷和治療上的困難性與復雜性。因此，研究并評價枝孢樣枝孢霉的致病性、溫度耐受性、藥物敏感性以及其基因多態(tài)性等諸多微生物學特性，將對于枝孢樣枝孢霉所致暗色絲孢霉病的診斷、治療及其預后具有重要的理論意義及實際價值。 目的：

2、 探討枝孢樣枝孢霉的致病性；觀察并比較枝孢樣枝孢霉與卡氏枝孢霉超微結構的差異，探討其可能的致病性差異；檢測枝孢樣枝孢霉對8種常用抗真菌藥物的敏感性，為治療枝孢樣枝孢霉感染提供抗真菌藥物的參考依據(jù)；觀察并比較枝孢樣枝孢霉與幾種常見致病性暗色真菌(裴氏著色真菌、緊密著色真菌、疣狀瓶霉、卡氏支孢霉、皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉、鏈格孢)的耐熱性，探討溫熱治療的必要性及可行性；研究枝孢樣枝孢霉及常見致病性暗色真菌基因多態(tài)性，初步了解它們在同屬內及

3、同種內，屬間及種間的基因遺傳相似性及遺傳變異性；枝孢樣枝孢霉及常見致病性暗色真菌蛋白組學比較研究，以了解枝孢樣枝孢霉與常見致病性暗色真菌蛋白質表達的差異。 方法與結果： (1)枝孢樣枝孢霉對小鼠的致病性：將枝孢樣枝孢霉的菌懸液分別接種于正常和免疫抑制小鼠的腹側皮膚，于接種后的第15、30、60天處死動物，取接種部位的皮膚組織和各臟器組織進行組織病理學檢查和逆培養(yǎng)。實驗組小鼠在皮膚接種部位均出現(xiàn)不同程度損害。并且隨著時間推

4、移，損害加重。損害部位皮膚組織逆培養(yǎng)均陽性，實驗小鼠均未見系統(tǒng)播散。 (2)將枝孢樣枝孢霉與卡氏枝孢霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長，在光學顯微鏡和透射電鏡下對臨床分離的枝孢樣枝孢霉與卡氏枝孢霉的形態(tài)學及超微結構進行比較研究。受試的兩種真菌在超微結構上有一定差異，枝孢樣枝孢霉易于發(fā)生衰老，其真菌細胞壁可出現(xiàn)顯著增厚等改變。 (3)枝孢樣枝孢霉的抗真菌藥物的敏感性試驗：參照美國國家實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的產

5、孢絲狀真菌試驗方案(M27-A)和(M38-P)。微量稀釋法進行最小抑菌濃度(MIC)測定，所選菌懸液終濃度為(0.4～5)×106cfu/mL，孵育溫度35℃，培養(yǎng)時間5～7d。測定枝孢樣枝孢霉對氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬、酮康唑、咪康唑、聯(lián)苯芐唑、益康唑、制霉菌素的最小抑菌濃度(MIC)。結果顯示，枝孢樣枝孢霉對伊曲康唑、特比萘芬、酮康唑、咪康唑、聯(lián)苯芐唑、益康唑、制霉菌素的敏感性均較高，而對氟康唑敏感性較差。 (4)真菌耐

6、熱試驗：所選擇的實驗溫度分別為37℃、45℃和55℃。隨機取各種菌液3管及安置溫度計的生理鹽水試管同時固定于水浴鍋內，待生理鹽水試管的溫度達到實驗溫度時，分別計時10min、30min、60min時，立即取出菌液并將其接種于裝有沙氏培養(yǎng)基的平皿中央并觀察生長情況。受試菌種的菌懸液經37℃、45℃不同時間處理后，再培養(yǎng)的生長情況未受影響，55℃處理后除皮炎外瓶霉、鏈格孢外其余菌種(包括枝孢樣枝孢霉)在55℃不同時間處理后生長均受不同程度影

7、響。而枝孢樣枝孢霉、卡氏支孢霉、甄氏外瓶霉培養(yǎng)溫度為37℃時即不生長，皮炎外瓶霉在42℃培養(yǎng)時即不生長，不同于其它菌株。 (5)隨機擴增DNA多態(tài)性分析：應用GenTLETMDNA提取試劑盒提取菌絲體DNA，以隨機擴增DNA多態(tài)法對18株暗色真菌的DNA指紋圖譜進行分析。共選用10個隨機引物進行擴增，篩選出3個具有穩(wěn)定、清晰DNA擴增帶型的引物，即引物1:5’-GAGCCCTCCA-3’，引物4:5’-GTCAGGGCAA-3’

8、和引物5:5’-CAGCACCCAC-3’。18株菌DNA帶型不完全相同，有一定的種間和種內的遺傳變異性和遺傳相似性腐生菌枝孢樣枝孢霉與其他部分暗色真菌位于同一樹組中。同種菌并不都具有遺傳相似性。 (6)雙向電泳技術及蛋白質譜分析：，蛋白質首先根據(jù)其等電點在pH梯度膠內等電聚焦，然后按照它們的相對分子量大小進行SDS-PAGE第二次電泳分離，從而獲得二維的蛋白質分離圖譜。結果表明枝孢樣枝孢霉的蛋白分離不易獲得清晰分離圖譜。

9、 結論： (1)枝孢樣枝孢霉對小鼠皮膚有較強的機會致病性。但對小鼠內臟器官的機會致病性較弱。 (2)枝孢樣枝孢霉和卡氏枝孢霉的超微結構有一定差異，枝孢樣枝孢霉易于發(fā)生衰老的現(xiàn)象在一定程度上提示其致病性要遜于卡氏枝孢霉。 (3)檢測枝孢樣枝孢霉對抗真菌藥物的敏感性是必要的和有價值的，但體外試驗僅可作為體內治療選藥的參考。 (4)并非所有暗色真菌經45℃或55℃處理后生長均被完全殺滅，部分暗色真菌僅表現(xiàn)為受

10、到抑制。對局部熱療的適宜溫度和作用形式因菌種不同而有差異。局部熱療與抗真菌藥物聯(lián)合應用對治療暗色真菌病是有益的。 (5)隨機擴增DNA多態(tài)性分析表明，包括枝孢樣枝孢霉在內的暗色真菌在屬內各種間不一定有遺傳相似性；但腐生菌與致病菌的DNA帶型未見明顯特征性差異，似乎還有一定遺傳相似性。 (6)枝孢樣枝孢霉的蛋白分離困難，不易獲得清晰的蛋白質分離圖譜，這可能與超微結構所見枝孢樣枝孢霉的真菌細胞壁明顯增厚有關。僅培養(yǎng)條件的改變