傘枝犁頭霉Absidia corymbifera AS2生物轉(zhuǎn)化富集黃芪甲苷研究.pdf

1、黃芪甲苷(ASI)是中藥黃芪中一種具有多種藥理活性的皂苷類化合物，為黃芪制劑質(zhì)量鑒定的指標(biāo)成分。黃芪甲苷生物活性突出，中藥一類新藥“黃芪甲苷葡萄糖注射液”作為治療缺血性心肌炎的藥物正在進(jìn)行Ⅲ期臨床研究。但由于黃芪甲苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無(wú)法進(jìn)行化學(xué)全合成，因此其來(lái)源主要依靠從黃芪植物中提取。而其在黃芪中含量又非常低，需要大量植物資源和有機(jī)溶劑，使大規(guī)模制備成為瓶頸。
　　 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)具有專一性強(qiáng)、污染少和轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于天然產(chǎn)

2、物的結(jié)構(gòu)改造。本研究在國(guó)家重大科技專項(xiàng)(2009ZX09301-011)的資助下，借鑒前人的研究經(jīng)驗(yàn)，采用微生物轉(zhuǎn)化富集技術(shù)，以黃芪總皂苷作為底物，通過(guò)發(fā)酵轉(zhuǎn)化提高黃芪甲苷含量。主要內(nèi)容是從篩選菌種開(kāi)始，建立了發(fā)酵轉(zhuǎn)化和從發(fā)酵液中分離提取黃芪甲苷的新方法，并成功分離獲得新的關(guān)鍵酶-黃芪皂苷去乙?；浮４送?，通過(guò)對(duì)可轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷的前體化合物的鑒定和轉(zhuǎn)化研究，假設(shè)了一條全新的微生物去乙?；患S芪甲苷的途徑。具體研究結(jié)果如下：
　　

3、 1、本研究首先從不同來(lái)源的霉菌中篩選到能夠高效轉(zhuǎn)化黃芪總皂苷生成黃芪甲苷的菌種--Absidia corymbifera AS2。以黃芪總皂苷為底物，在投料濃度為5g/L的情況下，轉(zhuǎn)化60 h，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到90.3％，黃芪甲苷的含量是原料中的3倍。產(chǎn)物黃芪甲苷主要集中在發(fā)酵上清液中，經(jīng)D101大孔吸附樹(shù)脂分離純化后，總回收率最高達(dá)到了62％，產(chǎn)品色譜純度達(dá)到95％以上。該發(fā)酵及純化工藝黃芪甲苷收率高，成本低，操作簡(jiǎn)便，避免使用有機(jī)

4、溶劑，有利于其工業(yè)化生產(chǎn)。
　　 2、本研究對(duì)黃芪總皂苷中可能轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷的前體化合物進(jìn)行了分析。采用常規(guī)硅膠柱和反相硅膠柱分離的方法，并以A.corymbifera AS2微生物轉(zhuǎn)化為指導(dǎo)，進(jìn)行前體化合物的分離和確認(rèn)，最終共分離到4個(gè)可轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷的皂苷類化合物。經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定4個(gè)前體化合物分別是astragalosideⅠ(AS-Ⅰ)，isoastragalosideⅠ(isoAS-Ⅰ)，astragalosideⅡ(AS-

5、Ⅱ)和isoastragalosideⅡ(isoAS-Ⅱ)。通過(guò)ELSD檢測(cè)與DAD掃描相結(jié)合的方法對(duì)四個(gè)前體化合物進(jìn)行純度鑒定，并采用ELSD吸收?qǐng)D譜的歸一化法對(duì)四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的純度進(jìn)行標(biāo)定，結(jié)果分別為AS-Ⅰ(97％)、isoAS-Ⅰ(97.4％)、AS-Ⅱ(98％)和isoAS-Ⅱ(98.7％)。建立了黃芪甲苷和4個(gè)前體化合物HPLC分析方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)對(duì)發(fā)酵轉(zhuǎn)化以及酶轉(zhuǎn)化過(guò)程的實(shí)時(shí)分析，進(jìn)行代謝途徑的研究。
　　 3、從

6、化學(xué)結(jié)構(gòu)分析來(lái)看，AS-Ⅰ(2'3'-di-OAc)和isoAS-Ⅰ(2'4'-di-OAc)比黃芪甲苷多兩個(gè)乙?；?；AS-Ⅱ(2'-OAc)和isoAS-Ⅱ(3'-OAc)比黃芪甲苷多一個(gè)乙?；?。這些結(jié)構(gòu)均可完全被A.corymbifera AS2轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷，提示該菌株可能存在去乙?；?。為了進(jìn)一步研究微生物轉(zhuǎn)化黃芪總皂苷生成黃芪甲苷的機(jī)制，本研究繼續(xù)對(duì)該微生物中可能存在的去乙酰化酶進(jìn)行分離純化。首先采用硫酸銨分步沉淀法濃縮粗酶液

7、中的目標(biāo)蛋白，再進(jìn)行Q-sepharose HP離子交換層析，在0.1 mol/L氯化鈉洗脫組份中發(fā)現(xiàn)了較高的酶活性。該組份經(jīng)phenyl-sepharose6 FF疏水層析，收集在0.7 mol/L硫酸銨洗脫的活性組份繼續(xù)進(jìn)行CHT陶瓷型羥基磷灰石柱層析，在24.5 mmol/L磷酸鉀洗脫組份中發(fā)現(xiàn)有較高的活性。最后采用1 mL Resource Q預(yù)裝柱層析獲得電泳純的活性蛋白。酶活力回收率和蛋白回收率分別為0.32％和0.075‰

8、。
　　 4、進(jìn)一步對(duì)分離獲得的黃芪皂苷去乙?；高M(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。以p-NPA為底物在pH7.0和30℃條件下的動(dòng)力學(xué)常數(shù)：米氏常數(shù)Km值為3.76 mmol/L；最大反應(yīng)速率Vmax為17.64 mmol/min/mg。以p-NPA為底物的最適反應(yīng)pH為8.0，在pH7.0-9.5范圍內(nèi)穩(wěn)定；最適反應(yīng)溫度為35-45℃；在小于45℃溫度范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。MS檢測(cè)分子量為36067 Da。采用SPITC修飾的PSD-MALDI質(zhì)