分子遺傳學(xué)筆記

1、11分子遺傳學(xué)緒論核酸的發(fā)現(xiàn):作為遺傳物質(zhì)所應(yīng)具備的條件：1多樣性：貯存并表達(dá)多種遺傳信息2連續(xù)性：準(zhǔn)確傳遞后代3穩(wěn)定性：物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定4多變性：有遺傳變化的能力一、DNA作為遺傳物質(zhì)的證據(jù)肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)病毒侵染大腸桿菌試驗(yàn)真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：某一基因型的細(xì)胞從周?chē)橘|(zhì)中吸收來(lái)自另一基因型的細(xì)胞的DNA而使它的基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。二、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)核酸的化學(xué)組成：核酸是以核苷酸為基本結(jié)構(gòu)單位，通過(guò)3’5’磷酸二

2、酯鍵形成的鏈狀多聚體。核苷酸(Nucleotide)：核苷(Nucleoside)，含氮堿基，戊糖；磷酸基團(tuán)三、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1、DNA雙螺旋模型的誕生：Watson在復(fù)性反應(yīng)中如何知道單鏈已經(jīng)結(jié)合成雙鏈了呢？可以通過(guò)哪些方法來(lái)檢測(cè)？(1)減色效應(yīng)（hpochromiceffect）測(cè)定光密度，即OD值（opticaldensity），DNA從單鏈變成雙鏈，OD260減少30%(2)羥基磷灰石柱層析，羥基磷灰石對(duì)雙鏈DNA吸附較牢，不

3、易吸附單鏈而使其通過(guò)七、分子雜交1特點(diǎn)是：(1)都是應(yīng)用復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理；(2)都必須有探針（probe）的存在。2探針就是用同位素或非同位素如熒光染料，生物素等標(biāo)記的短片段特異DNA或RNA序列。3雜交：不同來(lái)源的單鏈核酸經(jīng)堿基互補(bǔ)配對(duì)而形成的雙螺旋，DNADNADNARNADNA雜交可反映不同生物中DNA的共同序列和不同序列，研究生物的進(jìn)化，核酸雜交是現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)4常用的分子雜交方法_原位分子雜交（insituhybridiz

4、ation）_斑點(diǎn)雜交（dotblotting）_薩瑟雜交（Southernblot）_諾瑟雜交（Nthernhybridization）_Westernblotting八、DNA超螺旋結(jié)構(gòu)和拓?fù)洚悩?gòu)現(xiàn)象1生物體中大多數(shù)DNA是以超螺旋的形成存在，而缺少超螺旋的DNA則為松弛型DNA原核生物DNA，共價(jià)封閉環(huán)，再經(jīng)螺旋就成為超螺旋。真核生物DNA為線性，DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合之間的DNA可形成一個(gè)小“環(huán)”，類似共價(jià)封閉環(huán)，從而螺旋成為超螺旋

5、2正超螺旋：和DNA內(nèi)部雙螺旋纏繞方向相同的方向纏繞形成的超螺旋，結(jié)構(gòu)更加緊密。DNA每圈初級(jí)螺旋的堿基對(duì)小于10.5，則為正超螺旋3負(fù)超螺旋：DNA繞其軸與右手雙螺旋方向相反的方向纏繞所產(chǎn)生的超螺旋，結(jié)果減少每個(gè)堿基對(duì)的旋轉(zhuǎn)，每圈初級(jí)螺旋的堿基對(duì)大于10.5，則為負(fù)超螺旋。超螺旋是耗能過(guò)程，超螺旋的產(chǎn)生可能為能量的儲(chǔ)存形式4拓?fù)洚悩?gòu)現(xiàn)象拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ催化DNA鏈斷裂和重新連接。每次只作用于一條單鏈，無(wú)需ATP，功能是松弛DNA，代表：E

6、.coli拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，對(duì)單鏈DNA的親和力比雙鏈高，能識(shí)別負(fù)超螺旋區(qū)，使負(fù)超螺旋擴(kuò)大化而成松弛狀，該酶不能松弛正超螺旋；真核生物拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可結(jié)合1519核苷酸的雙鏈區(qū)域其斷裂點(diǎn)在此區(qū)域中間.該酶傾向于結(jié)合超螺旋而不是結(jié)合松弛DNA區(qū)域?qū)φ?fù)超螺旋都有松弛功能.拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ又稱DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAgyrase)，能催化斷裂和連接雙鏈DNA，需能量ATP參與，無(wú)堿基序列特異性，DNA旋轉(zhuǎn)酶結(jié)合到雙鏈閉環(huán)分子中在ATP

7、的作用下產(chǎn)生負(fù)超螺旋。無(wú)ATP時(shí)只能緩慢松弛負(fù)超螺旋而不能松弛正超螺旋。大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ主要功能是引入負(fù)超螺旋以抵消復(fù)制叉移動(dòng)所產(chǎn)生的正超螺旋，還具有形成或拆開(kāi)雙鏈DNA環(huán)連體的能力。該酶對(duì)DNA的結(jié)合順序是正超螺旋松弛負(fù)超螺旋5拓?fù)洚悩?gòu)酶的生物學(xué)功能：_恢復(fù)細(xì)胞過(guò)程產(chǎn)生的DNA超螺旋，如復(fù)制叉前的正超螺旋、轉(zhuǎn)錄時(shí)聚合酶前產(chǎn)生的正超螺旋。_防止細(xì)胞DNA過(guò)度超螺旋，維持超螺旋的穩(wěn)定水平。生物體內(nèi)5％負(fù)超螺旋，有利于基因的轉(zhuǎn)錄、基因組

8、穩(wěn)定、促進(jìn)重組。_去連環(huán)活性（大腸桿菌）、染色體凝縮（真核）、解開(kāi)纏繞DNA雙螺旋6拓?fù)洚悩?gòu)酶的催化反應(yīng)本質(zhì)：是先切割DNA的磷酸二脂鍵，改變DNA鏈環(huán)數(shù)后再連接，兼具DNA內(nèi)切酶和DNA連接酶的功能，但是它不能連接事先已經(jīng)存在的斷裂DNA，是DNA復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄中必需的酶九、常見(jiàn)DNA分子形式及相互關(guān)系Ⅰ型DNA：具正、負(fù)超螺旋的雙鏈環(huán)狀DNAS＝1.41；Ⅰ’型DNA：無(wú)超螺旋的雙鏈環(huán)狀DNA，是松弛型S=1.14；Ⅱ型DNA：一

9、條鏈或兩條鏈上有一個(gè)或幾個(gè)切口的雙鏈環(huán)狀DNAS=1.14；Ⅲ型DNA：線形雙鏈DNAS=1.00；崩潰DNA：Ⅰ型或Ⅰ’型DNA變性時(shí)，氫鍵斷裂但兩條鏈無(wú)法分離而緊密纏繞的分子S=3.0單鏈環(huán)狀DNA：S=1.14線狀單鏈DNA：S=1.30連環(huán)狀DNA：兩個(gè)Ⅰ型DNA環(huán)連而成。S1.41沉降系數(shù)：CsCl密度梯度離心時(shí)的表示單位。CsCl本身有梯度，在離心時(shí)將不同分子大小的物質(zhì)集中到它自身的不同梯度中。在同一種密度梯度離心條件下，沉

10、降系數(shù)大表示易沉淀，則具有較高的超螺旋。鑒定DNA超螺旋的手段。第二章染色體、基因組和基因一、原核生物和真核生物真核生物：有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)；遺傳物質(zhì)集中在有核膜包圍著的細(xì)胞核中與特殊的蛋白質(zhì)相33串聯(lián)重復(fù)基因和基因家族的區(qū)別??串聯(lián)重復(fù)基因各成分間有高度的序列一致性甚至完全相同以同一基本單位進(jìn)行重復(fù)?；蚣易甯鞒蓡T的差別較大，以各自為基本單元重復(fù)拷貝數(shù)較高，常有幾十～幾百個(gè)?；蚣易蹇截悢?shù)不高。非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)短而一致?；蚣易甯鞒蓡T的非

11、轉(zhuǎn)錄的間隔長(zhǎng)短不一.tRNA（4S基因)小分子，75～90個(gè)核苷酸，20余種氨基酸約由40余種tRNA。酵母tRNA，長(zhǎng)約140kb，有內(nèi)含子，但各內(nèi)含子沒(méi)有序列的共同性。串聯(lián)成堆排列，間隔區(qū)較大，重復(fù)基因的起源：?滾環(huán)模型，不等交換，突然復(fù)制假說(shuō)3、細(xì)胞器基因葉綠體、線粒體含有DNA，環(huán)狀、非重復(fù)。同一線粒體或葉綠體內(nèi)含有相同環(huán)狀DNA。均編碼自身所需的某些蛋白質(zhì)及rRNA、tRNA。其余所需的蛋白質(zhì)均由核基因編碼。葉綠體、線粒體的膜

12、不允許核酸的通過(guò)。其合成的rRNA，mRNA和tRNA只能在細(xì)胞器內(nèi)行使功能，進(jìn)行翻譯，合成系統(tǒng)是細(xì)胞器專用的。線粒體基因組呈母系遺傳方式受精卵中線粒體基因組幾乎都來(lái)自卵子在減數(shù)分裂過(guò)程中，卵子的線粒體DNA分子完全隨機(jī)地分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中人類線粒體基因組雙鏈環(huán)狀DNA基因排列高度緊湊，總長(zhǎng)為16569bp，約93％的順序參與基因的編碼DNA兩條鏈的堿基組成差異很大：重鏈（H鏈）富含鳥(niǎo)嘌呤輕鏈（L鏈）富含胞嘧啶細(xì)胞內(nèi)的數(shù)目：數(shù)千拷貝第

13、三章DNA復(fù)制DNAreplication一、復(fù)制概況1、半保留復(fù)制(Semiconservativereplication)復(fù)制時(shí)以解開(kāi)的雙鏈DNA中的一條鏈作為模板通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成另一條新鏈由新合成的子鏈與母鏈組成一新的DNA雙鏈其序列與母雙鏈完全相同.DNA復(fù)制的可能方式:分散復(fù)制，半保留，全保留1958Meselson和Stahl用實(shí)驗(yàn)證明了DNA的半保留復(fù)制機(jī)制2、制起點(diǎn)復(fù)、復(fù)制子、方向和方式復(fù)制起點(diǎn)(iO):復(fù)制是在

14、DNA分子的特定位點(diǎn)開(kāi)始的這一位點(diǎn)被稱為復(fù)制起點(diǎn).一般富含AT序列。復(fù)制起點(diǎn)的數(shù)目原核生物染色體通常只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制從起點(diǎn)開(kāi)始，進(jìn)行到終點(diǎn)結(jié)束，完成整個(gè)DNA分子的復(fù)制。（一個(gè)復(fù)制單元）真核生物染色體DNA的復(fù)制是從多個(gè)位點(diǎn)（多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)），一個(gè)DNA分子上具有多個(gè)復(fù)制單元。復(fù)制子(replicon)：復(fù)制從起始到結(jié)束的DNA單位稱為一個(gè)復(fù)制子，是基因組中能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位。在每個(gè)細(xì)胞分裂周期中，每個(gè)復(fù)制子只啟動(dòng)一次。復(fù)制子中含

15、有復(fù)制需要的控制元件。在復(fù)制的起始位點(diǎn)具有原點(diǎn)，在復(fù)制的終止位點(diǎn)具有終點(diǎn)（Terminus)??復(fù)制方向?復(fù)制可能是單向的，也可能是雙向的。這是由從原點(diǎn)形成一個(gè)或兩個(gè)復(fù)制叉決定的。?復(fù)制叉(Replicationfk)：復(fù)制發(fā)生的位點(diǎn)，是雙鏈分開(kāi)的復(fù)制起點(diǎn)位置。復(fù)制叉從i開(kāi)始沿著DNA移動(dòng)。一個(gè)復(fù)制叉：復(fù)制時(shí)復(fù)制叉移動(dòng)產(chǎn)生單向復(fù)制?二個(gè)復(fù)制叉：復(fù)制時(shí)相背向移動(dòng)，產(chǎn)生雙向復(fù)制大多數(shù)生物DNA都是以雙向等速方式進(jìn)行復(fù)制?雙向復(fù)制時(shí)復(fù)制叉的移

16、動(dòng)不對(duì)稱單核苷酸是在3‘端加上，復(fù)制方向或鏈的延伸方向：5’→3’復(fù)制方式復(fù)制叉式(θ復(fù)制)：在復(fù)制原點(diǎn)產(chǎn)生復(fù)制叉，雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制叉式類似“θ”，又稱θ復(fù)制。滾環(huán)式(Rollingcircle):DNA雙鏈環(huán)的一條鏈斷裂，5’端和特定的蛋白質(zhì)相連，而在3’端不斷由DNA聚合酶催化向前延伸，以未切斷的一條環(huán)鏈為模板進(jìn)行合成。老環(huán)中另一條親鏈的5’端不斷拋出，似一個(gè)環(huán)在滾動(dòng)。類似“δ”，又稱“δ”復(fù)制，被拋出的鏈到一定長(zhǎng)度時(shí)則開(kāi)始復(fù)制

17、其互補(bǔ)鏈。3、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性半不連續(xù)復(fù)制模型：DNA雙鏈中一條鏈的復(fù)制合成是連續(xù)的，另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的。1968年由岡崎等人提出：模板鏈（5’→3’）仍按堿基互補(bǔ)，但從反方向合成多個(gè)5′→3′DNA片段（岡崎片段），約長(zhǎng)10002000核苷酸。合成的方向和復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反。以3’5’鏈作為模板合成的DNA為先導(dǎo)鏈（leadingstr）以5’3’鏈作為模板合成的DNA為后隨鏈4、DNA聚合酶與DNA聚合反應(yīng)DNA復(fù)制是由DN

18、A聚合酶以四種核苷三磷酸為前體負(fù)責(zé)催化完成的。Knberg（1957）首次發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），以后又發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）和DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）poly(核苷酸)nOH3’dNTP→poly(核苷酸)n1OH3’ppi二、復(fù)制體系?多種酶和蛋白質(zhì)（E.coli中有30多種）參與DNA的復(fù)制。與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)稱為復(fù)制體系(Replisome)。?雙鏈DNA的復(fù)制是一個(gè)涉及酶活動(dòng)的復(fù)雜的聚合反應(yīng)過(guò)程，可分為起

19、始、延伸和終止三個(gè)不同的階段。.1、DNA復(fù)制體系的鑒定_利用條件致死突變體研究與復(fù)制有關(guān)的基因?溫度條件致死突變體：?快停突變體：當(dāng)溫度升高，復(fù)制立即停止，其基因產(chǎn)物是DNA鏈的延伸及岡崎片段的起始和連接所需的酶，與DNA延伸所需的酶和蛋白質(zhì)有關(guān)。?慢停突變體：當(dāng)溫度升高，可完成當(dāng)前復(fù)制，但不能開(kāi)始新一輪的復(fù)制，其基因產(chǎn)物與復(fù)制起始有關(guān)。蛋白質(zhì)鑒定方法：純化、重建、突變ProteinsinDNAReplication：1.DNA解旋酶

20、（DNAHelicases）2.單鏈結(jié)合蛋白（DNAsinglestredbindingproteins，SSB蛋白）3.DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNATopoisomerase)4.DNAPolymeraseDNAPolymeraseI(PolI)wasthefirstenzymediscoveredwithpolymeraseactivityitisthebestacterizedenzyme.Althoughthiswasthefirs

21、tenzymetobediscoveredthathadtherequiredpolymeraseactivitiesitisnottheprimaryenzymeinvolvedwithbacterialDNAreplication.ThatenzymeisDNAPolymeraseIII(PolIII).ThreeactivitiesareassociatedwithDNApolymeraseI5.引發(fā)酶（Primase）There

22、quirementfafree3hydroxylgroupisfulfilledbytheRNAprimersthataresynthesizedattheinitiationsitesbytheseenzymes.6.DNA連接酶（DNALigase）DNA復(fù)制是由DNA聚合酶以四種核苷三磷酸為前體負(fù)責(zé)催化完成的。DNApolymerasesareenzymesthatsynthesizeadaughterstr(s)ofDNA(un

23、derdirectionfromaDNAtemplate).Maybeinvolvedinrepairreplication.DNAreplicaseisaDNAsynthesizingenzymerequiredspecificallyfreplication.RepairofdamagedDNAcantakeplacebyrepairsynthesiswhenastrthathasbeendamagedisexcisedreplac

24、edbythesynthesisofanewstretch.Itcanalsotakeplacebyrecombinationreactionswhentheduplexregioncontainingthedamagedisreplacedbyanundamagedregionfromanothercopyofthegenome.DNApolymerasesaretheenzymesthatmakeDNASemiconservativ

25、ereplicationsynthesizestwonewstrsofDNA.RepairsynthesisreplacesadamagedstrofDNA.DNAsynthesisoccursbyaddingnucleotidestothe3’OHendofthegrowingchainsothatthenewchainissynthesizedinthe5’3’direction.TheprecursfDNAsynthesisisa

26、nucleosidetriphosphatewhichlosestheterminaltwophosphategroupsinthereaction.三種E.coliDNA聚合酶:?DNA聚合酶I:polA基因編碼103KD單鏈多肽，參與損傷DNA的修復(fù)，在半保留復(fù)制中起輔助作用。?DNA聚合酶II:12KD單鏈多肽，在損傷DNA的修復(fù)中具有一定作用。?DNA聚合酶III:多亞基組成的蛋白質(zhì)，是大腸桿菌中真正的DNA復(fù)制酶。真核生物DN

27、A聚合酶?:synthesisoflaggingstr.?:DNArepair.?:synthesisofleadingstr.?:DNArepair.3、DNA聚合酶引物?DNA聚合酶的一個(gè)共同特征是只能催化dNTPs加到已有核酸鏈的游離3’OH上，而不能以游離的單核苷酸起始DNA鏈的合成。因此，在起始合成時(shí)需要一段引物提(Primer)來(lái)提供3’OH末端才能合成DNA。?～10核苷酸的RNA片斷，與模板鏈結(jié)合，保證DNA復(fù)制的保真度

28、，前導(dǎo)鏈和后隨鏈都需引物。?引物由特殊的RNA聚合酶合成，稱引發(fā)酶（primase）。由dnaG基因編碼，單肽鏈，引發(fā)酶與相關(guān)蛋白結(jié)合形成的復(fù)合體為引發(fā)體（primosome）。4、螺旋酶?又稱解旋酶（helicase）促進(jìn)雙鏈解開(kāi)，是復(fù)制、重組、修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵酶。依賴ATP水解所產(chǎn)生的能量來(lái)解旋DNA雙鏈，螺旋酶在DNA上移動(dòng)解開(kāi)雙鏈。?主動(dòng)機(jī)制：解旋酶的兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)與DNA結(jié)合后，使結(jié)合區(qū)域雙鏈DNA失去穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)解旋。?被動(dòng)機(jī)制：