課件：多基因病的分子遺傳學(xué)

1、多基因病的 分子遺傳學(xué) 唐吟宇,主要內(nèi)容：第一節(jié) 多基因病的一般特征第二節(jié) 多基因病的研究方法（重點(diǎn)難點(diǎn)）第三節(jié) 糖尿病的分子遺傳學(xué),第一節(jié) 多基因病的一般特征,一 特征1、病種多: 如高血壓、冠

2、心病、動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、高脂蛋白血癥、糖尿病、胃及十二指腸潰瘍、精神分裂癥、風(fēng)濕病、癲癇、甲亢、 唇裂、腭裂、先天性心臟病等。,2、發(fā)病率高 （群體發(fā)病率）：家庭復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)比較： 單基因遺傳?。?5%—50%， 多基因遺傳?。?%—10%。群體發(fā)病率比較： 單基因?。旱陀?/10000， 多基因病：超過1/1000，有些1%—10%。,3、危害性大 （直接危害人類的生存與健康

3、） 4、病因復(fù)雜 ( 遺傳因素和環(huán)境因素） 5、微效性 6、累加作用 7、對(duì)其研究具有前沿性,,,多基因病是復(fù)雜疾病，遺傳因素有以下特點(diǎn)：1）參與發(fā)病的遺傳因素多于一個(gè)，每個(gè)基因通過對(duì)中間 性狀的影響直接或間接地促進(jìn)疾病的發(fā)生；2）每個(gè)基因參與發(fā)病的程度不同，大多數(shù)基因的作用較小， 但也可由一個(gè)或幾個(gè)基因呈主基因效應(yīng)；3）每個(gè)基因只賦予個(gè)體某種程度的易患性，但每個(gè)基因的 作用不足以致病，也并

4、非致病所需，需要多個(gè)基因累加 起來才會(huì)致病；4）各基因參與發(fā)病的機(jī)制可能是，各自對(duì)不同的代謝途徑 產(chǎn)生影響，疾病的最終發(fā)生是各基因在不同途徑作用的 綜合結(jié)果；5）各基因致病效應(yīng)的累積加上環(huán)境因素的作用構(gòu)成了個(gè)體的 疾病易患性，當(dāng)易患性超過一定閾值時(shí)即可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。,二 概念（易患性與發(fā)病閾值） 1、 易患性（liability) 人群中易患性變異：呈正態(tài)分布。 2、

5、發(fā)病閾值（threshold)： 易患性達(dá)到或超過一定的限度后就 會(huì)發(fā)病，該限度的易患性即發(fā)病值。,,,群體的易患性平均值： 從該群體的發(fā)病率作出估計(jì)，即群體發(fā)病率是測(cè)量易患性平均值的依據(jù)。,3、 遺傳度 (heritability) 多基因病的易患性由遺傳因素和環(huán)境因素共同引起，其中遺傳因素所起作用的相對(duì)大小稱為遺傳度（heritability）。

6、,遺傳度提供的其他信息： 若通過患者同胞發(fā)病率計(jì)算的遺傳度高于其他親屬發(fā)病率計(jì)算的遺傳度，或者遺傳度超過100%，則提示單基因遺傳病的可能性。,三 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的一般規(guī)律 1、 遺傳度高低； 2 、患者親屬級(jí)別：一級(jí)親屬的發(fā)病率 為群體發(fā)病率的開方值; 3、 家庭中患者數(shù)量; 4 、患者病情嚴(yán)重程度； 5、 近親婚配； 6、 性別。,第二節(jié) 多基因病的研究方法

7、 當(dāng)前對(duì)多基因病的研究，主要是 尋找疾病的主基因，或易感基因， 并試圖闡明其遺傳機(jī)制。 主要方法： 關(guān)聯(lián)分析 (association study) 連鎖分析 (linkage analysis) 基因組篩查 (genomic scanning) 候選基因研究 (candidate gene study),一、關(guān)聯(lián)分析 (

8、association study) 比較患者組與對(duì)照組某遺傳標(biāo)記出現(xiàn)的頻率，從而判斷遺傳標(biāo)記與疾病關(guān)系的研究方法。,關(guān)聯(lián)分析，選擇與疾病代謝有關(guān)的蛋白或酶的基因作為候選基因，在其位置已知的情況下，首先選取該基因內(nèi)部或附近的多態(tài)性位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記。然后進(jìn)行病例-對(duì)照研究，比較病例組與對(duì)照組在遺傳標(biāo)記位點(diǎn)等位基因出現(xiàn)的頻率，如果遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的頻率在病例組和對(duì)照組有顯著差異，則該標(biāo)記與疾病關(guān)聯(lián)。 對(duì)于

9、復(fù)雜性狀的多基因病，關(guān)聯(lián)分析較連鎖分析更為有效。因?yàn)殛P(guān)聯(lián)分析研究對(duì)象是病人和正常人，無需家系資料；且更容易找出只有微弱效應(yīng)的基因；即使顯示關(guān)聯(lián)的標(biāo)記不是造成疾病的變異，但很可能與變異連鎖。因此關(guān)聯(lián)分析更適合于多基因遺傳模式。,,若差異極為顯著，則遺傳標(biāo)記與疾病關(guān)聯(lián)。表明有三種可能：1、遺傳標(biāo)記與致病基因座不在一 條染色體上；2、 遺傳標(biāo)記與致病基因座在一 條染色體上；3、遺傳標(biāo)記本身即致病基因座

10、（與 疾病的發(fā)生機(jī)理有直接的關(guān)系）。 遺傳標(biāo)記主要是微衛(wèi)星DNA（STR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）。,二、連鎖分析 (linkage analysis) 連鎖分析是分析兩基因在染色體上相互關(guān)系的方法，通常是應(yīng)用已知位點(diǎn)的遺傳標(biāo)記，在患者家系中進(jìn)行分析，從而確定該致病基因在染色體上的粗略位置。,連鎖分析，是確定兩個(gè)遺傳標(biāo)記或者更多遺傳標(biāo)記之間的物理關(guān)系，以確定致病基因的位置。它根據(jù)生殖

11、細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，染色體發(fā)生交換和重組的原理，如果標(biāo)記與特定基因位于不同的染色體，那么向子代傳遞時(shí)，它們將會(huì)發(fā)生自由分離；反之，如果標(biāo)記與特定基因位于同一染色體且相距較近，在傳遞過程中，它們將不會(huì)發(fā)生自由分離，而呈現(xiàn)共分離的現(xiàn)象（行為一致）。利用這個(gè)原理，如發(fā)現(xiàn)某個(gè)標(biāo)記物與疾病存在（很強(qiáng)的）連鎖關(guān)系，則可將疾病相關(guān)基因確定在和該遺傳標(biāo)記（非隨機(jī)）共同傳遞的區(qū)域。該方法的好處是它將致病基因限定在一個(gè)小的范圍內(nèi)，以便進(jìn)一步尋找

12、引起疾病的突變。不足之處是，不能直接發(fā)現(xiàn)致病基因，且很難收集到合適的大家系。所以在探索多基因病相關(guān)基因的應(yīng)用中受到一定限制。,三、基因組篩查 (genomic scanning) 是指在不需要事先了解該基因位置、生物學(xué)功能、致病機(jī)制的情況下，利用高密度的多態(tài)性標(biāo)記，通過全基因組掃描，劃定與疾病相關(guān)的易感區(qū)域，再在此區(qū)域內(nèi)選擇適當(dāng)?shù)亩鄳B(tài)性標(biāo)記精細(xì)掃描，然后根據(jù)連鎖分析的方法，評(píng)價(jià)疾病與標(biāo)記物的相關(guān)性，

13、從而定位與疾病相關(guān)的染色體區(qū)域或致病基因。,其流程如下：1、家系收集及基因組DNA提取；2、微衛(wèi)星標(biāo)記或SNP標(biāo)記的選擇；3、標(biāo)記的引物合成和PCR擴(kuò)增；4、電泳檢測(cè)（基因分型）；5、等位片段分析（通過電腦）；6、基因組掃描綜合分析：計(jì)算LODS值（兩基因 非隨機(jī)出現(xiàn)的概率與隨機(jī)出現(xiàn)的概率之比， 再取對(duì)數(shù)），若某個(gè)標(biāo)記的LODS值大于3 （比值大于103），即可肯定標(biāo)記與致病基因 連鎖，進(jìn)

14、而將致病基因定位在標(biāo)記所在區(qū)域內(nèi)。,,全基因組篩查：選擇并使用覆蓋23條染色體上的、密度適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記，結(jié)合家系進(jìn)行分析； 部分基因組篩查：選擇并使用覆蓋某一條染色體或其部分區(qū)段上的、密度適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記，結(jié)合家系進(jìn)行分析。,四、 候選基因研究(candidate gene study) 基于對(duì)代謝途徑的認(rèn)識(shí)(已知代謝途徑）， 選擇關(guān)鍵酶的基因,作為疾病的候選

15、基因, 研究 其編碼順序或非編碼順序與疾病的關(guān)系。 即 研究患者中該基因的編碼序列是否有基因突變； 非編碼序列是否有多態(tài)性位點(diǎn)基因與調(diào)控關(guān)聯(lián) 或與調(diào)控連鎖。 確認(rèn)或排除候選基因是否致病基因。 進(jìn)而可能克隆疾病基因，用于基因診斷或 藥物生產(chǎn)。,綜上所述，目前對(duì)于多基因病易感基因的研究，主要有兩種方法： 1、候選基因策略的關(guān)聯(lián)分析； 2、全基

16、因組掃描的連鎖分析。,,比較：對(duì)于多基因病而言，關(guān)聯(lián)分析可能比連鎖分析更有效。因?yàn)殛P(guān)聯(lián)分析相對(duì)于連鎖分析更易找到只有很微小效應(yīng)的基因。而且不需要很難找到的家系。 結(jié)論： 關(guān)聯(lián)分析更適合于多基因遺 傳的模式。,對(duì)幾種方法作選擇時(shí)需要考慮的因素： 家系、樣本數(shù)、經(jīng)費(fèi)、已有資源、研究時(shí)間、疾病等。,第三節(jié) 糖尿病的分子遺傳學(xué) 糖尿?。╠iabetes mellitus，DM)，乃多

17、基因病復(fù)雜性的代表。是繼腫瘤、心血管疾病之后第3位嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病。全世界約有1. 5億多患者，其研究已經(jīng)成為世界性的難題。 可分為： 胰島素依賴性糖尿?。↖DDM） I 型糖尿病 T1DM 非胰島素依賴性糖尿病（NIDDM）II型糖尿病 T2DM 占 90%

18、 發(fā)病率：城市近10%； 農(nóng)村3%。,糖尿病，其遺傳機(jī)制的復(fù)雜性歷來是遺傳學(xué)家頭痛的問題。 from headache to nightmare.,一、當(dāng)前研究方法：1、候選基因法 確定一個(gè)或數(shù)個(gè)在糖代謝中起重要作用的酶的基因，在群體或家系中研究這個(gè)基因與發(fā)病的關(guān)系。 研究患者中該基

19、因的編碼序列是否有突變；非編碼序列是否有多態(tài)性位點(diǎn)與基因調(diào)控關(guān)聯(lián)或連鎖（不平衡）。以確認(rèn)是否致病基因。,候選基因有：醛糖還原酶基因（AR）、血管緊張素—Ⅰ轉(zhuǎn)換酶基因（ACE）、血管緊張素原基因（AGT）、一氧化氮合成酶基因（NOS）、葡萄糖激酶基因（GCK）、胰島素基因、胰島素受體基因等。,2、遺傳標(biāo)記排除作圖法（連鎖分析法） 尋找與糖尿病發(fā)病相關(guān)的分子遺傳學(xué)標(biāo)記。通常對(duì)糖尿病家系進(jìn)行

20、連鎖分析，確定或排除某一區(qū)段與糖尿病的尚未知的致病基因連鎖。這是對(duì)未知代謝途徑研究的有效方法。 以上兩種方法，既有區(qū)別，也有聯(lián)系。,I 型糖尿病相關(guān)基因位點(diǎn)比較肯定，主要有：IDDM1—15。 II 型糖尿病相關(guān)基因位點(diǎn)正在進(jìn)行大量研究，現(xiàn)已報(bào)道的陽性重復(fù)位點(diǎn)主要有：20q12-13 、1q21-23 、 12p13、7q21 等。,二、主要候選基因或基因位點(diǎn)（一） HLA II

21、類抗原基因與 T1DM 的關(guān)聯(lián) 1、HLA基因譜 HLA是多基因家族中的超基因，位于6號(hào)染色體短臂。見示意圖。,,,復(fù)等位基因數(shù)： II類基因區(qū)有4個(gè)亞區(qū)，每個(gè)亞區(qū)的等位基因數(shù) 分別是：DP區(qū)6個(gè)、D區(qū)26個(gè)、DQ區(qū)9個(gè)、DR區(qū)20個(gè)。 一條染色體上的每個(gè)亞區(qū)內(nèi)都各有多個(gè)α、β鏈 基因，基因產(chǎn)物為糖蛋白。分別由各亞區(qū)α、β基因 合成α和β鏈，再形成非共價(jià)二聚

22、體。,2、HLA-DR 和 HLA-DQ 與 T1DM 的關(guān)聯(lián)（1）DR3、DR4、DRw6 DRw8與 T1DM 關(guān)聯(lián)。（2）DQ基因區(qū)與 T1DM 的相關(guān)性比DR基因區(qū)更強(qiáng)。 例如，0.2%的美國(guó)人為 T1DM 所困，而攜帶DR3和DR4的白人發(fā)病率是正常人的20倍。,（3）DQ β基因可能決定 T1DM 的易感性和耐受性。（4）可能有某單倍型的幾個(gè)位點(diǎn)共同參與了 T1DM 的易感性。,（二）

23、其它1型糖尿病的易感位點(diǎn) IDDM2 胰島素基因 IDDM3 15q26 IDDM4 D11S1253-1374 IDDM5 6q25與雌激素受體基因連鎖 IDDM6 18S478 IDDM7 2q31(谷氨酸脫羧酶抗體基因） IDDM8 6q25-27 IDDM9 IDDM10 D10S193-588

24、 IDDM11 14q24.3-q31D14S67與糖尿病連鎖 IDDM12 D2S272(2q33)（細(xì)胞毒素相關(guān)因子） IDDM13 D2S164（2q24) IDDM15 6q21(與HLA連鎖）,,雖已報(bào)道15個(gè)易感位點(diǎn)，但還會(huì)有新 位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)。還需要進(jìn)行研究以便確認(rèn)或排除。還需進(jìn)一步精細(xì)定位，進(jìn)而克隆易感基因，闡明易感基因的生物學(xué)功能。,（三）胰島素基因

25、 人胰島素基因位于11p15, 由1355bp組成，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。5’側(cè)翼區(qū)是調(diào)節(jié)順序，啟動(dòng)子位于第一個(gè)外顯子上游25bp處，第一外顯子上游168bp—258bp之間的順序?yàn)樵鰪?qiáng)子。該基因區(qū)稱為IDDM2。,胰島素是最為保守的生物大分子之一，哺乳類動(dòng)物之間的胰島素基因結(jié)構(gòu)差異很小。 人胰島素基因突變很少發(fā)生在編碼區(qū)，因此，胰島素基因突變不是糖尿病的主要病因。,在胰島素基因5’側(cè)翼區(qū)，在距

26、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)363bp處，有一個(gè)高度變異區(qū)（INS 5’HVR），其重復(fù)單位為14bp(ACAGGGGTGTGGGG),可將其作為一個(gè)遺傳標(biāo)記。按此HVR的長(zhǎng)度，可將其分為三型等位基因Ⅰ型等位基因：小于600bp 重復(fù)40多次Ⅱ型等位基因：600---1600bp 重復(fù)80多次Ⅲ型等位基因：1600---2470bp 重復(fù)160多次,三型基因按孟德爾方式傳遞，人群中存在六種基因型：Ⅰ/Ⅰ Ⅰ/Ⅱ Ⅰ/

27、Ⅲ Ⅱ/Ⅱ Ⅱ/Ⅲ Ⅲ/Ⅲ 在歐美（高加索人種），糖尿病患者Ⅰ型等位基因的頻率顯著高于對(duì)照。,（四）胰島素受體基因 胰島素作用于靶細(xì)胞需要胰島素受體與之結(jié)合。胰島素受體是一種質(zhì)膜糖蛋白，它由連接胰島素的兩個(gè)α亞單位和具有酪氨酸激酶活性的兩個(gè)β亞單位組成。,胰島素受體基因突變使受體與胰島素的結(jié)合性降低，產(chǎn)生靶細(xì)胞抵抗胰島素的現(xiàn)象，這主要是 T2DM 的特征。 總之，胰島素受體基

28、因突變可導(dǎo)致糖尿病，但基因的保守性，決定其也不是糖尿病的主要原因。,（五）葡萄糖激酶（GCK）基因 GCK存在于肝臟和胰島的β細(xì)胞，GCK對(duì)血糖的調(diào)節(jié)如下圖：,,,血糖（-）,,血糖（+）,,,β細(xì)胞葡萄糖感受器（胰島GCK）,,胰島素（+）,,肝葡萄糖感受器（+） （肝GCK）,,,如果GCK活性降低，正常代謝平衡出現(xiàn)紊亂，則導(dǎo)致血糖增高，引起糖尿病。,1、GCK基因結(jié)構(gòu)及多態(tài)性 GCK基因定位于7p13,

29、由12個(gè)外顯子，11個(gè)內(nèi)含子組成。這12個(gè)外顯子從5’向3’方向依次命名為1B、1H、1C、2、3、4、5、6、7、8、9、10，其中1B僅出現(xiàn)在胰島細(xì)胞，而1H和1C僅出現(xiàn)于肝細(xì)胞，其他外顯子在兩種組織內(nèi)相同。,,這種組織特異性是由基因的特異啟動(dòng)子所決定的，即組織不同啟動(dòng)子不同，在GCK基因的不同部位轉(zhuǎn)錄，形成各自特異的GCKmRNA。,在GCK基因區(qū)3’端處，發(fā)現(xiàn)3個(gè)（GC）n、2個(gè)（GA）n 不連續(xù)串聯(lián)重

30、復(fù)序列，即GCK微衛(wèi)星DNA多態(tài)性標(biāo)志之一，稱為GCK-1。,現(xiàn)發(fā)現(xiàn)GCK-1含有七個(gè)等位基因，將含195bp的等位基因命名為Z，其他六種分別為Z+2、Z+4、Z+6、Z+8、Z+10、Z-15。它們的不同之處就在于上述不連續(xù)雙核苷酸重復(fù)序列長(zhǎng)度不同，如Z+2含197bp,Z-15含180bp,依此類推。,2、GCK基因與 T2DM 的關(guān)聯(lián) 美國(guó)黑人Z+4等位基因與 T2DM 關(guān)聯(lián)，可看成該人群 T2

31、DM 的遺傳標(biāo)記。 毛里求斯人Z+2等位基因與 T2DM 關(guān)聯(lián)。 白人、印第安人Z等位基因與 T2DM 負(fù)關(guān)聯(lián)。,3、GCK基因突變與MODY型糖尿病 目前已知，GCK基因突變是MODY的病因一：GCK基因第七外顯子發(fā)生無意義突變（Glu-279-----AM),即谷氨酸-----提前終止，或發(fā)生錯(cuò)義突變（Gly-261-----Arg),即谷氨酰胺-----精氨酸。突變的GCK改變了與葡萄糖的親

32、合力，還引起細(xì)胞的ATP/ADP比值改變，干擾了胰島素的分泌，導(dǎo)致MODY發(fā)生。,（六）NOS基因 一氧化氮作為細(xì)胞信號(hào)傳遞的信使是近年來生命科學(xué)的重要成就，一氧化氮（NOS）合成酶基因與糖尿病的關(guān)系應(yīng)受到關(guān)注。 人類NOS由多個(gè)基因編碼，可分為誘導(dǎo)型（iNOS）、神經(jīng)元型（nNOS）和內(nèi)皮細(xì)胞型（eNOS）。,,NOS是內(nèi)源性NO生成的限速酶。影響NO

33、S基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的因素都可以影響NO的生成。iNOS定位于17cen→q11.2區(qū)域，長(zhǎng)約37kb，包含26個(gè)外顯子。nNOS定位于12q24.2-24.31,長(zhǎng)約120kb，有28個(gè)外顯子。eNOS定位于7q35-36，長(zhǎng)約21kb,有26個(gè)外顯子。,在糖尿病微血管并發(fā)癥鼠中發(fā)現(xiàn)eNOS表達(dá)下降，iNOS表達(dá)增加。iNOS基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)可能與歐洲人的2型糖尿病相關(guān)。在南非，觀測(cè)到nNOS基因的

34、7、9等位基因在2型糖尿病患者中顯著增多。在eNOS基因中發(fā)現(xiàn)四種突變可能影響糖尿病的微血管并發(fā)癥。,,我們研究了中國(guó)漢族人iNOS基因和eNOS基因微衛(wèi)星DNA各等位基因與2型糖尿病的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)iNOS基因(CCTTT)14和(CCTTT)15與DM負(fù)相關(guān)；eNOS基因（CA）34與DM正相關(guān)。 對(duì)DM及其并發(fā)癥發(fā)生機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。有必要進(jìn)一步研究正常人群和DM及微血管病變患者NOS基因編碼區(qū)的差異。,單核苷酸

35、多態(tài)性（SNPs）是穩(wěn)定的分子標(biāo)志，基因編碼區(qū)的SNPs可引起密碼子改變，導(dǎo)致氨基酸變化并改變酶蛋白的構(gòu)象，致使原有功能喪失或降低。擬進(jìn)行NOS基因的分子流行病學(xué)研究。,三、IDDM與NIDDM的遺傳流行病學(xué) 對(duì)于多基因病的基因分離，首先要回答有多少基因參與，是否有主基因的作用。 流行病學(xué)研究表明，IDDM和NIDDM都很可能有主基因的作用。 主基因到哪里去尋找呢？,要從大量的適合分析的患者家系中

36、去尋找。家系中有較多的患者，其遺傳背景又相近，應(yīng)用分子生物學(xué)方法，有可能找到糖尿病的相關(guān)基因。 因此，家系是國(guó)家的重要遺傳學(xué)資源，國(guó)家對(duì)此進(jìn)行嚴(yán)格的歸口管理。,IDDM已經(jīng)找到許多相關(guān)基因位點(diǎn)。NIDDM的研究進(jìn)展緩慢。據(jù)計(jì)算，IDDM的λs值（同胞患病率/群體患病率）可達(dá)15以上，而NIDDM的λs值較低（有的僅3.5)。,在不同地區(qū)、不同民族，某些家系的NIDDM的λs值可能較高，有望構(gòu)成NIDDM的

37、亞型。 因此，對(duì)這些家系的核心家系，判明遺傳方式后，可用遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，排除或確認(rèn)標(biāo)記位點(diǎn)與NIDDM的連鎖關(guān)系，從而為基因定位和克隆提供依據(jù)。,基因研究要有適合的家系。“找到好的家系如同發(fā)掘到寶藏”這種說法并不夸張?？蛇x擇以下方法尋找易感基因： 1、大家系的連鎖分析 2、大量核心小家系的連鎖分析 3、患者同胞對(duì)分析,其它多基因病的分子遺傳學(xué)研究策略與糖尿病的研究相