密度離心法

1、密度離心法是樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。該法的優(yōu)點(diǎn)是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，既能分離具有沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；③顆粒不會(huì)積壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。缺點(diǎn)：①離心時(shí)間較長(zhǎng)；②需要制備梯度；③操作嚴(yán)格，不宜掌握。等密度離心法1原理等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)

2、的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液或和梯度液先混合，離心開始后，當(dāng)梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)原來(lái)分布均勻粒子也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，粒子上??；在彎頂處粒子密度大于介質(zhì)密度時(shí)，則粒子沉降，最后粒子進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置即粒子密度等于介質(zhì)密變，此時(shí)dr／dt為零粒子不再移動(dòng)，粒子形成純組分的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大

3、小和其他參數(shù)無(wú)關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長(zhǎng)離心時(shí)間也不能改變這些粒子的成帶位置。2注意點(diǎn)：①離心時(shí)間要長(zhǎng)②可用角式轉(zhuǎn)頭或水平式轉(zhuǎn)頭③粒子密度相近或相等時(shí)不宜用④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度⑤不能用剎車四、梯度溶液的制備(一)梯度材料的選擇原則：1與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)，且易與所分離的生物材料分開。2可達(dá)到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強(qiáng)度和pH變化較小。3不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。4容易

4、純化，價(jià)格便宜或容易回收。5濃度便于測(cè)定，如具有折光率。6對(duì)于分析超迷離心工作來(lái)說(shuō)，它的物理性質(zhì)，熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是己知的。(二)梯度材料的應(yīng)用范圍下面簡(jiǎn)單介紹幾種常用的密度梯度材料的性質(zhì)及其應(yīng)用范圍。1蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其最高密度可達(dá)133gml，且由于價(jià)格低，容易制備，是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細(xì)胞的分離。2聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll—

5、400也就是相對(duì)分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。3氯化銫：是一種離于性介質(zhì)、水溶性大，最高密度可達(dá)1.91g／nd。由于它是重金屬鹽類，在離心時(shí)形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價(jià)格較貴。4鹵化鹽類：KBr和NaCI可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，