蛋白非變性膠詳解

1、NativePAGE原理原理非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(NativePAGE)是在不加入SDS疏基乙醇等變性劑的條件下，對(duì)保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于同工酶的鑒定和提純。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過(guò)程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性，對(duì)于生物大分子的鑒定有重要意

2、義，其方法是在凝膠上進(jìn)行兩份相同樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色，對(duì)某個(gè)特定的生物大分子進(jìn)行鑒定，另一半用于所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性sdspage電泳在操作上基本上是相同的，只是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS等。一般蛋白進(jìn)行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時(shí)候，要利用低pH凝膠系統(tǒng)，分離酸性蛋

3、白時(shí)候，要利用高pH凝膠系統(tǒng)。酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統(tǒng)，蛋白會(huì)帶負(fù)電荷，蛋白會(huì)相陽(yáng)極移動(dòng)；而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，這時(shí)候需要將陰極和陽(yáng)極倒置才可以電泳分離酸性蛋白。工作液配制1.40%膠貯液(Acr:Bis=29：1）；2.4分離膠Buf(1.5MTrisHCl，pH8.8)：18.2gTrisbase溶于ml水，用濃HCl調(diào)pH8.8，加水定容到100ml，4℃貯存；3.

4、4堆積膠Buf(0.5MTrisHCl，pH6.8)：6gTrisbase溶于80ml水，用濃HCl調(diào)pH6.8，加水定容到100ml，4℃貯存；4.10電泳Buf（pH8.8TrisGly）:30.3gTrisbase，144g甘氨酸，加水定容到L，4℃貯存；5.2溴酚藍(lán)上樣Buf:1.25mlpH6.80.5MTrisCl，3.0ml甘油，.2ml0.5%溴酚藍(lán)，5.5mldH2O；20℃貯存；電泳結(jié)束以后，切取部分染色，然后根據(jù)染

5、色結(jié)果切取含有蛋白質(zhì)的膠帶裝入處理過(guò)的透析袋中，加入適量的緩沖液，最后把透析袋放入普通的核酸電泳槽中，并在電泳槽中加入適量的緩沖液（和透析袋中的緩沖液相同），低溫電泳23小時(shí)即可。回收蛋白所用的緩沖液一般和電泳所用的緩沖液相同。SDSPAGE和NativePAGE的比較的比較非變性凝膠電泳，也稱為天然凝膠電泳，與非變性凝膠電泳最大的區(qū)別就在于蛋白在電泳過(guò)程中和電泳后都不會(huì)變性。最主要的有以下幾點(diǎn)：1.凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS

6、，而變性凝膠的有SDS。2.電泳載樣緩沖液中非變性凝膠的不僅沒(méi)有SDS，也沒(méi)有巰基乙醇。3.在非變性凝膠中蛋白質(zhì)的分離取決于它所帶的電荷以及分子大小，不像SDSPAGE電泳中蛋白質(zhì)分離只與其分子量有關(guān)。4.非變性凝膠電泳中，酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的，不像SDSPAGE中所有蛋白都朝正極泳動(dòng)。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通常是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，需要將陰極和陽(yáng)極倒置才可以電泳。5.因?yàn)槭欠亲冃阅z電泳，所有的電泳時(shí)候

7、電流不能太大，以免電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量太多導(dǎo)致蛋白變性，而且步驟都要在04度的條件下進(jìn)行，這樣才可以保持蛋白質(zhì)的活性，也可以降低蛋白質(zhì)的水解作用。這點(diǎn)跟變性電泳也不一樣。所以與SDSPAGE電泳相比，非變性凝膠大大降低了蛋白質(zhì)變性發(fā)生的機(jī)率問(wèn)題和解答問(wèn)題和解答1.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)預(yù)電泳是怎么回事的？預(yù)電泳時(shí)要加6DNA上樣緩沖液?jiǎn)?？電?－2小時(shí)再加結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物嗎？預(yù)電泳是除去凝膠中沒(méi)有聚合的單體和雙體和聚合引發(fā)劑，提高分辨率，不