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文檔簡介
1、經(jīng)常有戰(zhàn)友對一些常見問題在丁香園反復(fù)問答了很多遍,所以希望園子中一些戰(zhàn)友,特別是低分與0分戰(zhàn)友,能將好的帖子歸納總結(jié)了一下,并結(jié)合自己的經(jīng)驗整理,一方面這是個學(xué)習(xí)提高的過程,另一方面也能幫助大家解決這方面的問題。同時如有不當(dāng)或不完善的地方,希望各位戰(zhàn)友不斷補充,爭取有朝一日我們能把園子里戰(zhàn)友的經(jīng)驗系統(tǒng)整理,給大家以幫助。我先把設(shè)計引物如何設(shè)計酶切位點這方面的帖子整理一下,因為昨天一下子看到三個相似問題。原帖如下:我想向你求教一個問題假如
2、說我想把胰島素基因和腺病毒載體連接起來如何確定設(shè)計目的基因PCR時的引物呢和相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶呢謝謝老師能給予講解謝謝[整理]:最初的時候,由于害怕設(shè)計酶切位點最后切不開,所以經(jīng)常采用最通用的方法,用T載體克隆解決問題,但后來發(fā)現(xiàn)她也有問題,就是濃度提不上去,你需要體大量的載體來酶切,所以感到還是直接擴(kuò)增好一點。但這就需要你仔細(xì)設(shè)計引物。連入質(zhì)粒中的重要目的就是進(jìn)行酶切和連接,當(dāng)然首先就是在想要合成或者是進(jìn)行PCR擴(kuò)增出靶基因的時候
3、在核酸的兩端接入酶切位點,酶切位點是與你的質(zhì)粒的特點相關(guān)的,可以在質(zhì)粒的圖譜說明書上找取相應(yīng)的位點,進(jìn)行設(shè)計。(一)設(shè)計引物前應(yīng)做的準(zhǔn)備工作:準(zhǔn)備載體圖譜,大致準(zhǔn)備把片斷插在那個部分對片斷進(jìn)行酶切分析,確定一下那些酶切位點不能用準(zhǔn)備一本所買公司的酶的商品目錄,便于查酶的各種數(shù)據(jù)及兩種酶是否可以配用(二)設(shè)計引物所要考慮的問題兩個位點應(yīng)是載體上的,,所連接片斷上沒有這兩個位點,且距離不能太近,往往導(dǎo)致兩個酶都切不好。因此,緊挨在一起,只能
4、切一個,除非恰好是與上面兩個酶在一起的酶切位點。我看promega的說明書上說,最好隔四個。還有一種情況是:不能有堿基的交叉,比如AGATCTTAAG,這樣的位點比較難切。兩個酶切點最好不要是同尾酶(切下來的殘基不要互補),否則效果相當(dāng)于單酶切。最好使用酶切效率高的。關(guān)于引物二聚體,最好用primer或是其他設(shè)計引物的軟件進(jìn)行計算一下,看看引物之間的△G(自由能)的絕對值,如果小于10,一般是問題的。如果稍大,PCR時可以提高一下退火溫
5、度,一般是沒有問題的。如果3’端形成二聚體,并且自由能絕對值較大,如果PCR沒有條帶,建議重新設(shè)計引物。此外,所加的三個核苷酸的保護(hù)序列經(jīng)過盡心設(shè)計有時也可以降低二聚體的△G。在設(shè)計酶切位點時,最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因為,一個特異性引物一般都是20bp左右,再加上酶切位點序列和保護(hù)性堿基,大致就是28bp左右了。而我們在設(shè)計退火溫度時,與引物的長度有關(guān),比正常的引物(20bp)的Tm肯定要高一些。如果我們能利用引物自身
6、的部分序列,就可以有效地減少引物的長度。還有,有些酶是離不開末端序列的,因此,在設(shè)計一個酶位點時,最好把該酶的性質(zhì)弄清楚設(shè)計時限制性酶切位點是應(yīng)該在5’端的頂端。在設(shè)計引物時,常在5‘端添加酶切位點,以利于PCR產(chǎn)物連接到載體。設(shè)計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。先用軟件設(shè)計出合適的引物,引物的3’端是引發(fā)延伸的起點,因此一定要與模板準(zhǔn)確配對,應(yīng)盡量避免在引物3’端的第一位堿基是A。(容易錯配)引物3’端最佳堿基的選擇是G和C
7、,因為他們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。目的序列上并不存在的附加序列,如限制位點和啟動子序列,可以加入到引物5端而不影響特異性。當(dāng)計算引物Tm值時并不包括這些序列,但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。酶切位點都需要保護(hù)堿基以利于內(nèi)切酶的有效切割。酶切位點前加保護(hù)堿基1,兩個酶切點至少隔上3個堿基,在做載體構(gòu)建的時候設(shè)計引物擴(kuò)增片段進(jìn)行定向連接,除了酶切位點,還要在兩端加一個三個核苷酸的保護(hù)序列,否則PCR產(chǎn)物很難被酶切,因此就會導(dǎo)致連
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