限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基

1、寡核苷酸近末端位點(diǎn)的酶切寡核苷酸近末端位點(diǎn)的酶切(Cleavage(CleavageCloseClosetotothetheEndEndofofDNADNAFragmentsFragments(oligonucleotides))(oligonucleotides))為了解不同內(nèi)切酶對(duì)識(shí)別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識(shí)別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于確定雙酶切順序?qū)?huì)有幫助（比如在多接頭上

2、切割位點(diǎn)很接近時(shí)），或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近DNA末端時(shí)也很有用。在本表中沒(méi)有列出的酶，則通常需在識(shí)別位點(diǎn)兩端至少加上6個(gè)保護(hù)堿基，以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法：用γ[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A260單位的寡核苷酸。取1g已標(biāo)記了的寡核苷酸與20單位的內(nèi)切酶，在20C條件下分別反應(yīng)2小時(shí)和20小時(shí)。反應(yīng)緩沖液含70mMTrisHCl(pH7.6)10mMMgCl25mMDTT及適量的NaCl或KCl（視酶的具體要

3、求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實(shí)驗(yàn)采用自連接的寡核苷酸作為對(duì)照。若底物有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則可能因?yàn)槌霈F(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。DNA合成，新鏈的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位點(diǎn)因?yàn)閮?nèi)切酶除了有特異的識(shí)別位點(diǎn)之外，還需多幾個(gè)無(wú)需特異性的堿基提供一個(gè)platfm讓它可以結(jié)合上去，否則會(huì)掉下來(lái).引物的結(jié)構(gòu)就是（5→3）：保護(hù)堿基酶切位點(diǎn)原來(lái)的引物序列首先要看目的基因中是否含有該酶

4、切位點(diǎn)，只有沒(méi)有的才可以選(小蝦米酶切位點(diǎn)分析)。其次，如果需要做表達(dá)，需要考慮起始密碼子，防止移碼突變切割率切割率%酶寡核苷酸序列寡核苷酸序列鏈長(zhǎng)鏈長(zhǎng)2hr20hrAccIGGTCGACCCGGTCGACCGCCGGTCGACCGG81012000000AflIIICACATGTGCCACATGTGGCCCACATGTGGG810120909009090IGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA8101290909

5、0909090AvaICCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA81012509090909090GGAATTCCATATGGAATTCCGGGAATTCCATATGGAATTCCC202275759090NheIGGCTAGCCCGGCTAGCCGCTAGCTAGCTAG810120101002550NotITTGCGGCCGCAAATTTGCGGCCGCTTTAAAATATGCGGCCGCTATAAAATAAGAA

6、TGCGGCCGCTAAACTATAAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA1216202428010102525010109090NsiITGCATGCATGCACCAATGCATTGGTTCTGCAGTT122210909090PacITTAATTAAGTTAATTAACCCTTAATTAAGG8101200002590PmeIGTTTAAACGGTTTAAACCGGGTTTAAACCCAGCTTTGTTTAAACGG

7、CGCGCCGG8101224000750255090PstIGCTGCAGCTGCACTGCAGTGCAAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8142224260109090001090900PvuICCGATCGGATCGATCGATTCGCGATCGCGA81012010002510SacICGAGCTCG81010SacII