離心技術(shù)-2018.9

1、1,醫(yī)學(xué)分析與檢測技能學(xué) 謝富華 博士、副教授贛南醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室,2,課程內(nèi)容3次理論課：離心原理與技術(shù)、常用標(biāo)記技術(shù)、其它實(shí)驗(yàn)技術(shù)（電泳、PCR等）12次實(shí)驗(yàn)課：實(shí)驗(yàn)基本技能操作、醋酸纖維薄膜電泳、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定、血清總膽固醇的測定、紙層析鑒定轉(zhuǎn)氨基作用、轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒提取、PCR、質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳鑒定、細(xì)胞吞噬、凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)、ELISA,3,參考書考核方式考查

2、開卷,4,第一章 離心原理與技術(shù),生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室兩大“神器”,神器一：PCR儀,5,數(shù)字微滴式PCR儀（1臺，約125萬）,實(shí)時(shí)定量PCR儀（1臺，約42萬）,6,梯度PCR儀（3臺，約7萬/臺）,普通PCR儀（3臺，約5萬/臺）,神器二：離心機(jī),7,臺式超速離心機(jī)（1臺，約46萬）,多功能高速冷凍離心機(jī)（1臺，約16萬/臺）,高速冷凍離心機(jī)（11臺，約6.5萬/臺）,8,高速離心機(jī)（4萬-3臺，1.2萬-17臺）,

3、低速離心機(jī)（8臺，約0.5萬/臺）,主 要 內(nèi) 容,離心技術(shù)的發(fā)展簡史離心的基本原理離心機(jī)的分類與構(gòu)造離心機(jī)使用注意事項(xiàng)常用離心方法及應(yīng)用,9,學(xué)習(xí)要求,掌握離心機(jī)的分類和使用注意事項(xiàng)熟悉離心的基本原理與構(gòu)造、常用離心方法及應(yīng)用了解離心技術(shù)的發(fā)展簡史,10,11,一、離心技術(shù)的發(fā)展簡史我國古代人用陶罐人工分離蜂蜜和牛奶；19世紀(jì)中葉歐洲人發(fā)明三足式紡織品脫水機(jī)和上懸式制糖機(jī)；1872年，Misher使用離心機(jī)分離蜂蜜

4、和牛奶；,12,隨后，各式各樣的離心機(jī)相繼問世；1924年Svedberg發(fā)明世界上第一臺超速離心機(jī)，為日后Hb相對分子量測定奠定基礎(chǔ)；,Svedberg(瑞典)1926年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),13,1926年，Svedberg用其制造的離心機(jī)測定馬血紅蛋白平均分子量為68 000；1940年，Svedberg和Pederson撰寫了世界上第一本有關(guān)離心技術(shù)的專著；1955年，Anderson發(fā)明區(qū)帶轉(zhuǎn)頭離心機(jī)；,14,二、離心的基本原理

5、,利用轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時(shí)所產(chǎn)生的強(qiáng)大離心力，加快顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)的或浮力密度差的物質(zhì)分離開。,15,離心技術(shù)相關(guān)的概念,離心力（centrifugal force，F(xiàn)）相對離心力（relative centrifugal force，RCF）沉降速度（sedimentation velocity，v）沉降系數(shù)（sedimentation coefficifent，S）沉降時(shí)間（sedimentation time

6、，t）,16,（一）離心力,懸浮顆粒在離心過程中所受的離開旋轉(zhuǎn)中心軸的作用力，稱為離心力（centrifugal force，F(xiàn)）F=mω2r（m：顆粒質(zhì)量，ω：旋轉(zhuǎn)角速度 ，r：顆粒離旋轉(zhuǎn)軸中心的距離）,17,指在離心力場中，顆粒顆粒所受的離心力相當(dāng)于它受到地球引力的倍數(shù)，單位是重力加速度，用（×g）表示；RCF=mω2r/mg=4π2n2r/(3600×980)=1.119× 10-5 n2r；n：

7、轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)(revolutions per minute ，rpm)；,（二）相對離心力,19,轉(zhuǎn)頭從管口至管底的各點(diǎn)與旋轉(zhuǎn)軸之間的距離不同，故計(jì)算RCF時(shí)取旋轉(zhuǎn)體平均半徑；,rav=( r min＋rmax) / 2,相同的轉(zhuǎn)速n（rpm），對不同轉(zhuǎn)子其產(chǎn)生的相對離心力RCF（×g）卻不同；,RCF=1.119× 10-5 n2r,離心條件要用RCF（×g）,21,左對左右對右,Dole和Cotz

8、ias制作了rpm、RCF和r三者關(guān)系的列線圖。,22,（三）沉降速度（v）沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)顆粒沉降的距離；,r為顆粒半徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρP為顆粒密度；ρm為介質(zhì)密度,23,（四）沉降系數(shù)（S ） 1924年Svedberg指出沉降系數(shù)是指顆粒在單位離心力場中沉降速度。,當(dāng)ρP＞ρm，則S＞0，粒子順著離心方向沉降；當(dāng)ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到 平衡；當(dāng)ρP＜ρm，則S＜0，粒

9、子逆著離心方向上?。?24,S的單位是秒（s），1 S = 10-13s；S為生物大分子物質(zhì)的特征常數(shù)，與顆粒的密度、大小、形狀、介質(zhì)的密度和黏度有關(guān)；,細(xì)菌核糖體70S,大亞基（50S）,小亞基（30S）,25,用沉降系數(shù)測定物質(zhì)的相對分子量；,R為氣體常數(shù)；T為熱力學(xué)溫度；S為分子的沉降系數(shù)；D為分子擴(kuò)散系數(shù)；V-微分比容，即溶質(zhì)密度的倒數(shù)；ρ為溶劑密度；,26,（一）離心機(jī)的分類按速度：低速、高速和超速；按用途：實(shí)驗(yàn)型和

10、工業(yè)型按使用溫度：常溫和冷凍按驅(qū)動(dòng)方式：手搖、油渦輪、氣動(dòng)、電動(dòng)和磁懸,三、離心機(jī)的分類與構(gòu)造,工業(yè)離心機(jī),2024/3/30,低速離心機(jī)nmax=6000rpm，RCFmax=6000g轉(zhuǎn)速控制不夠準(zhǔn)確 一般無制冷，多在室溫下操作用于細(xì)胞和血樣的分離制備。,2024/3/30,高速離心機(jī)nmax= 25 000rpm，RCFmax= 89 000g轉(zhuǎn)速、溫度和時(shí)間可嚴(yán)格控制 一般有制冷系統(tǒng)用于菌體、細(xì)胞碎

11、片和大細(xì)胞器等的分離制備,2024/3/30,超速離心機(jī)nmax<100 000rpm，RCFmax<800 000g轉(zhuǎn)速、溫度和時(shí)間精密控制必須有制冷和制動(dòng)裝置用于小細(xì)胞器（核糖體）和病毒等的分離制備。,臺式超速離心機(jī),立式超速離心機(jī),30,,驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)：油輪驅(qū)動(dòng)、空氣渦輪、磁懸浮、電動(dòng)防護(hù)系統(tǒng)：減震、自平衡、甲鋼外套、自限速、自限溫、自鎖定，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)不易打開等還有：制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、潤滑系統(tǒng)

12、配件：離心轉(zhuǎn)頭和離心管,（二）離心機(jī)的基本構(gòu)造,2024/3/30,31,1. 離心轉(zhuǎn)頭的類型角式轉(zhuǎn)頭（fixed angle rotor）蕩平式轉(zhuǎn)頭 （swinging bucket rotor）垂直轉(zhuǎn)頭（vertical tube rotor）區(qū)帶轉(zhuǎn)頭 （zonal rotor）連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭 （continuous flow rotor）分析轉(zhuǎn)頭（analytical rotor）,32,角式轉(zhuǎn)頭離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定

13、傾角（20～40度），角度越大沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好； 壁效應(yīng)：管側(cè)會出現(xiàn)沉積，而影響分離效果；常用于S或沉降速度相差較大的樣品。,33,蕩平式轉(zhuǎn)頭 由多個(gè)可活動(dòng)吊桶（離心套管）構(gòu)成；被分離的樣品帶垂直分布于離心管縱軸；適合密度梯度離心。,34,垂直轉(zhuǎn)頭樣品顆粒的沉降距離短，離心時(shí)間短，適合于快速密度梯度離心分離不充分，停機(jī)后樣品易發(fā)生混合,35,2.離心轉(zhuǎn)頭的材質(zhì)鋁合金：強(qiáng)度不高，易受鹽、溫度影響，易腐蝕，但易加工

14、不銹鋼：強(qiáng)度高、耐腐蝕、質(zhì)量大提速慢、難加工鈦合金轉(zhuǎn)頭：強(qiáng)度高、耐腐蝕、質(zhì)量小提速快、難加工、價(jià)格貴碳素：強(qiáng)度高、耐腐蝕、質(zhì)量小提速快、易加工、價(jià)格貴,36,3. 轉(zhuǎn)頭的主要參數(shù)最大轉(zhuǎn)速及過速保護(hù)裝置最大離心力最大容量,37,4. 離心管種類一般玻璃管：只能在低速離心機(jī)上使用；塑料管：化學(xué)性能穩(wěn)定，半透明，能耐高溫消毒，但易變形，不耐腐蝕；不銹鋼管：強(qiáng)度大、不變形、耐腐蝕。,2024/3/30,38,離心管的注意事項(xiàng)：

15、對稱平衡 （包括質(zhì)量和樣品高度）；提防離心管內(nèi)液體外溢；超速離心一定要加滿離心管，需抽真空；杜絕使用變形老化離心管；離心前要蓋嚴(yán)管蓋(防外泄、揮發(fā)、變形)。,2024/3/30,39,四、離心機(jī)使用注意事項(xiàng),40,安放：平穩(wěn)、堅(jiān)固的支持面，尤其是大容量低速、高速和超速離心機(jī)；,低速大容量離心機(jī) 高速離心機(jī) 超速離心機(jī),41,離心前務(wù)必平衡離心管和內(nèi)容物（包括質(zhì)量和液面高度），并對

16、稱放置；,對稱放置,,42,根據(jù)需求選擇適宜的轉(zhuǎn)子和離心管；嚴(yán)禁使用破損、裂紋和被腐蝕的轉(zhuǎn)子；嚴(yán)禁使用過期、老化、裂紋、受腐蝕的離心管；更換離心轉(zhuǎn)子時(shí)要輕取輕放，嚴(yán)禁撞擊；,裂紋 受腐蝕,43,離心前檢查密封圈，對好螺紋旋緊轉(zhuǎn)子蓋( ! )，蓋好離心機(jī)蓋；啟動(dòng)后待速度達(dá)到預(yù)設(shè)值并正常運(yùn)行一段時(shí)間后方可離開，若發(fā)現(xiàn)不正常現(xiàn)象（異常噪音、抖動(dòng)等）應(yīng)

17、立即停機(jī)檢查原因；,44,離心過程中不能禁止打開離心機(jī)蓋；離心結(jié)束后待轉(zhuǎn)子停止轉(zhuǎn)動(dòng)方可開蓋；操作結(jié)束后要擦拭離心機(jī)腔室，關(guān)掉電源，寫好使用記錄；離心機(jī)日常保養(yǎng)要防塵、防潮、防腐蝕；長期不用時(shí)，低速開機(jī)1-2次/月，0.5h/次。,五、常用離心方法及應(yīng)用,離心是制備和分析生物樣品的重要手段；目前離心方法有：一般制備離心（分離血清和沉淀細(xì)胞等）超速制備離心（差速沉降和密度區(qū)帶）分析超速離心（研究生物大分子的特性）,2024/3/

18、30,差速離心差速離心法用于細(xì)胞和細(xì)胞器的分級分離；原理：利用不同的粒子在離心力場中沉降速度不同而被分離；,2024/3/30,47,差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份,差速離心的分辨率不高，常用于其他分離手段之前的粗制品提取;優(yōu)點(diǎn)：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子;缺點(diǎn)：須多次離心，沉淀中有夾帶，不能一次得到純顆粒；有“壁效應(yīng)”；沉淀于管底的顆粒受擠壓，易變性失活；效率低，費(fèi)時(shí)。,48,