中藥學之第九章、發(fā)酵工藝控制

1、第八章、發(fā)酵工藝控制,本章內容：第一節(jié)、發(fā)酵過程中的主要控制參數第二節(jié)、發(fā)酵過程中的代謝變化第三節(jié)、菌體濃度影響及其控制第四節(jié)、基質的影響及其控制第五節(jié)、溫度的影響及其控制第六節(jié)、pH的影響及其控制第七節(jié)、溶氧的影響及其控制第八節(jié)、二氧化碳的影響及其控制第九節(jié)、補料的作用和控制第十節(jié)、泡沫的影響及其控制第十一節(jié)、發(fā)酵終點的判斷,了解發(fā)酵工藝過程控制的重要性,發(fā)酵是一種很復雜的生化過程，其好壞涉及諸多因素。除了菌種的

2、生產性能，還與培養(yǎng)基的配比、原料的質量、滅菌條件、種子的質量、發(fā)酵條件、過程控制等有密切的關系。由于高產菌種對工藝條件的波動比低產菌種更敏感，通常菌種的生產性能越高，其生產條件越難滿足。發(fā)酵生產受許多因素的影響和工藝條件的制約，故掌握生產菌種的代謝規(guī)律和發(fā)酵調控的基本知識對生產的穩(wěn)定和提高具有重要的意義。,第一節(jié)、發(fā)酵過程中的主要控制參數,本節(jié)內容: 一、物理參數二、化學參數三、生物參數,參數可以反映發(fā)酵工藝的變化,影響發(fā)酵的

3、因素太多。有些因素還是未知的，且其主要影響因素也會變化。因此了解發(fā)酵工藝條件對發(fā)酵過程的影響和掌握反映菌的生理代謝和發(fā)酵過程變化的規(guī)律，可以幫助人們有效地控制微生物的生長和生產。與微生物發(fā)酵有關的參數，可分為物理、化學和生物三類。,參數控制流程,常用工業(yè)發(fā)酵儀器,一、物理參數,溫度（℃）壓力（Pa）攪拌轉速(r/min)攪拌功率（kW） 空氣流量（V/(V·min)）粘度（Pa·s 或kg.s/m2）濁

4、度（％）料液流量（L／min）,二、化學參數,1．pH（酸堿度）2．基質濃度（g或mg％）3．溶解氧濃度（ppm或飽和度，％）4．氧化還原電位（mV）5．產物的濃度（μg（u）／ml）6. 廢氣中的氧濃度（Pa）7. 廢氣中的CO2濃度（％）細胞生物活性的其它化學參數：如NAD－NADH體系、ATP－ADP－AMP體系、DNA、RNA、生物合成的關鍵酶等,三、生物參數,1．菌絲形態(tài) 絲狀菌發(fā)酵過程中菌絲形態(tài)的改變是生化

5、代謝變化的反映。一般都以菌絲形態(tài)作為衡量種子質量、區(qū)分發(fā)酵階段、控制發(fā)酵過程的代謝變化和決定發(fā)酵周期的依據之一。2．菌體濃度 菌體濃度的大小和變化速度對菌體的生化反應都有影響。在生產上，常常根據菌體濃度來決定適合的補料量和供氧量，以保證生產達到預期的水平。,第二節(jié)、發(fā)酵過程中的代謝變化,本節(jié)內容:一、分批發(fā)酵二、補料—分批發(fā)酵三、半連續(xù)（發(fā)酵液帶放）四、連續(xù)發(fā)酵,一. 分批發(fā)酵,1. 分批發(fā)酵的基礎理論分批發(fā)酵的物料平衡微

6、分方程：,X為菌體濃度 g/Lt為培養(yǎng)時間 h μ為比生長速率 h-1 S為基質濃度 g/Lqs為比基質消耗速率 g/（g.h)p為產物濃度 g/Lqp為比產物形成速率 g/(g.h),分批發(fā)酵過程一般可粗分為四期，即適應（停滯）期、對數生長期、生長穩(wěn)定期和死亡期,比生長速度μ,式中X0為菌的初始濃度；Xt為經過培養(yǎng)時間t的菌度。將菌體濃度的自然對數與時間作圖可得一直線，其斜率為μ，即比生長速率。,生長關聯型和非生長關聯型

7、,(1). 生長關聯型 根據產物的形成是否與菌體生長同步關聯，將產物形成動力學分為生長關聯型和非生長關聯型。一般，初級代謝產物的形成與生長關聯；而次級代謝產物的形成與生長無關。(2). 非生長關聯型 此類型的產物形成只與細胞的積累量有關，而與產物形成速率與菌的生長速率無關。次級代謝產物中的一些抗生素的產物合成即屬于這一類。,殺假絲菌素分批發(fā)酵中的葡萄糖耗，DNA含量和殺假絲菌素合成的變化,2. 分批發(fā)酵的重要生長參

8、數,A B X＝Y（S0－St）S0為初始基質濃度，g／LSt為經培養(yǎng)時間t的基質濃度Y為得率系數，g細胞/g基質,C D μ＝μmaxS/(KS＋S)μmax是最大比生長速率，h-1；KS為基質利用常數，相當于μ＝μmax／2時的基質濃度，g／L,,,3. 分批發(fā)酵的優(yōu)缺點,優(yōu)點： 即操作簡單，周期短，染菌的機會減少和生產過程、產品質量易掌握。 缺點：

9、 存在基質抑制問題，出現二次生長（diauxic growth）現象。如對基質濃度敏感的產物，或次級代謝物，抗生素，用分批發(fā)酵不合適，因其周期較短，一般在1～2天，產率較低。,二. 補料(流加)-分批(fed-batch)發(fā)酵,1. 補料-分批發(fā)酵的理論基礎 由于只有料液的輸入，沒有輸出，因此，發(fā)酵液的體積在增加。若分批培養(yǎng)中的細胞生長受一種基質濃度的限制，則在任一時間的菌濃可用式表示： Xt＝X0+Y（S0－S

10、t） 在St接近S0時補料，輸入的基質等于細胞消耗的基質。故dS／dt＝0，雖培養(yǎng)液中的總菌置XT隨時間的延長而增加，但細胞濃度Xt并未提高，即dX／dt＝0，這種情況稱為準穩(wěn)態(tài)。隨時間的延長，稀釋速率將隨體積的增加而減少。,2. 分批補料的優(yōu)點,與傳統(tǒng)的分批發(fā)酵相比，優(yōu)點在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質濃度。低基質濃度的優(yōu)點：（1）可以除去快速利用碳源的阻遏效應，并維持適當的菌體濃度，使不至于加劇供氧的矛盾；（2）克服養(yǎng)

11、分的不足，避免發(fā)酵過早結束。,三、 半連續(xù)發(fā)酵,在補料-分批發(fā)酵的基礎上加上間歇放掉部分發(fā)酵液（行業(yè)中稱為帶放）便可稱為半連續(xù)發(fā)酵。帶放是指放掉的發(fā)酵液和其他正常放罐的發(fā)酵液一起送去提煉工段。放掉部分發(fā)酵液，再補入適當料液不僅補充養(yǎng)分和前體而且代謝有害物被稀釋，從而有利于產物的繼續(xù)合成。,半連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)點,（1）可以除去快速利用碳源的阻遏效應，并維持適當的菌體濃度，使不至于加劇供氧的盾。（2）克服養(yǎng)分的不足，避免發(fā)酵過早結束。（

12、3）緩解有害代謝產物的積累,半連續(xù)發(fā)酵的不足,①放掉發(fā)酵液的同時也丟失了未利用的養(yǎng)分和處于生產旺盛期的菌體；②定期補充和帶放使發(fā)酵液稀釋，送去提煉的發(fā)酵液體積更大；③發(fā)酵液被稀釋后可能產生更多的代謝有害物，最終限制發(fā)酵產物的合成；④一些經代謝產生的前體可能丟失；⑤有利于非產生菌突變株的生長。,四、 連續(xù)發(fā)酵,連續(xù)培養(yǎng)是發(fā)酵過程中一邊補入新鮮的料液，一邊以相近的流速放料，維持發(fā)酵液原來的體積。1、 單級連續(xù)發(fā)酵的理論基礎

13、可用D來表示其稀釋速率（h-1）： D=F／V F為料液流速，L／h V為發(fā)酵液的體積，L 在一定時間內細胞濃度的凈變化dX／dt為： dX／dt＝μX－DX μX為生長速率，g／（L·h） DX為細胞排放速率，g／（L·h）,在穩(wěn)態(tài)條件下dX／dt,dX／dt＝0，即μX＝DX，故μ＝D，即在穩(wěn)態(tài)條件下可通過補料

14、速率來控制比生長速率，因V不變。以μ＝μmax S/（Ks+S）代入 dX／dt＝μX－DX 得： dX/dt＝[(μmaxS)/（Ks+S）－D]X KS為基質利用常數，相當于μ＝μmax／2時的基質濃度，g／L,在穩(wěn)態(tài)條件下殘留基質濃度的凈變化dS／dt,dS／dt＝基質的輸入-基質的輸出-細胞的消耗 dS/dt＝DS0一DS一XμmaxS/[Y(Ks+S)] 在穩(wěn)態(tài)下，dX/dt＝dS/dt＝0 S＝

15、KsD/(μmax－D)Y為得率系數，g細胞/g基質KS為基質利用常數，相當于μ＝μmax／2時的基質濃度，g／L X和S分別為穩(wěn)態(tài)細胞濃度和穩(wěn)態(tài)殘留基質濃度,式S＝KsD/(μmax－D)解釋了D如何控制μ。,細胞生長將導致基質濃度下降，直到殘留基質濃度等于能維持μ＝D的基質濃度。如基質濃度消耗到低于能支持相關生長速率的水平，細胞的丟失速率將大于生成的速率，這樣S將會提高，導致生長速率的增加，平衡又恢復。,2、 多級連續(xù)培養(yǎng),基

16、本恒化器的改進有多種方法，但最普通的辦法是增加罐的級數和將菌體送回罐內。,恒化器,連續(xù)培養(yǎng)濃縮菌體兩種辦法：,①限制菌體從恒化器中排出，讓流出的菌體濃度比罐內的??；②將流出的發(fā)酵液送到菌體分離設備中，如讓其沉積或將其離心，再將部分濃縮的菌體送回罐內。部分菌體返回罐內的凈效應為：罐內的菌體濃度增加了；這導致殘留基質濃度比簡單恒化器?。痪w和產物的最大產量增加；臨界稀釋速率也提高。菌體反饋恒化器能提高基質的利用率，可以改進料液濃度不同的系

17、統(tǒng)的穩(wěn)定性，適用于被處理的料液較稀的品種，如釀造和廢液處理。,3、 連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點,連續(xù)培養(yǎng)有以下優(yōu)點：（1）維持低基質濃度：可以除去快速利用碳源的阻遏效應，并維持適當的菌體濃度，使不至于加劇供氧的矛盾；（2）避免培養(yǎng)基積累有毒代謝物；（3）可以提高設備利用率和單位時間的產量，節(jié)省發(fā)酵罐的非生產時間；（4）便于自動控制。,連續(xù)培養(yǎng)也有缺點：,（1）長時間的連續(xù)培養(yǎng)難以保證純種培養(yǎng)；（2）菌種發(fā)生變異的可能性較大,第三節(jié)、菌體

18、濃度影響及其控制,本節(jié)內容:一、影響菌生長速率的因素二、菌濃度對發(fā)酵產物得率的影響三、菌濃度的控制,菌體（細胞）濃度,菌體（細胞）濃度（簡稱菌濃，cell concentration）是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。,一、影響菌生長速率的因素,1、 菌濃的大小與菌體生長速率有密切關系。 典型的細菌、酵母、霉菌和原生動物的倍增時間分別為45分鐘、90分鐘、3小時和6小時左右。2、菌體的增長與營養(yǎng)物質和環(huán)境條件有密切關系,二

19、、菌濃度對發(fā)酵產物得率的影響,①發(fā)酵產物的產率與菌體濃度成正比關 系②菌濃過高則會產生不利的影響 攝氧速率與傳氧速率相平衡時的菌體濃度，是臨界菌體濃度,三、菌濃度的控制,控制菌濃的方法： 菌體的生長速率，在一定的培養(yǎng)條件下，主要受營養(yǎng)基質濃度的影響，所以要依靠調節(jié)培養(yǎng)基的濃度來控制菌濃。1、首先要確定基礎培養(yǎng)基配方中有個適當的配比，以避免產生過濃（或過稀）的菌體量2、然后通過中間補料來控制，如當菌體生長緩慢、菌濃

20、太稀時，則可補加一部分磷酸鹽，促進生長，提高菌濃；但補加過多，則會使菌體過分生長，超過臨界濃度，對產物合成產生抑制作用。3、利用菌體代謝產生的CO2量來控制生產過程的補糖量，以控制菌體的生長和濃度,第四節(jié)、基質的影響及其控制,本節(jié)內容:一、碳源的種類和濃度影響和控制二、氮源的種類和濃度影響和控制三、磷酸鹽濃度的影響和控制,基質的影響及其控制,基質是產生菌代謝的物質基礎，既涉及菌體的生長繁殖，又涉及代謝產物的形成。

21、它們及其代謝產物又是許多調節(jié)控制機制的效應劑，也影響產物的形成。,一、碳源的種類和濃度影響和控制,1）、迅速利用的碳源：葡萄糖、蔗糖等。迅速參與代謝、合成菌體和產生能量，并產生分解產物，有利于菌體生長，但有的分解代謝產物對產物的合成可能產生阻遏作用 。,2）、緩慢利用的碳源,緩慢利用的碳源：多數為聚合物、淀粉等。為菌體緩慢利用，有利于延長代謝產物的合成，特別有利于延長抗生素的分泌期，也有許多微生物藥物的發(fā)酵所采用。在工業(yè)上，發(fā)酵培

22、養(yǎng)基中常采用含迅速和緩慢利用的混合碳源,二、氮源的種類和濃度影響和控制,（1）迅速利用的氮源：氨基（或銨）態(tài)氮的氨基酸（或硫酸銨等）、玉米漿容易被菌體利用，促進菌體生長，但對某些代謝產物的合成特別是某些抗生素的合成產生調節(jié)作用，影響產量,2）緩慢利用的氮源,延長代謝產物的分泌期、提高產物的產量；但一次投入也容易促進菌體生長和養(yǎng)分過早耗盡，以致菌體過早衰老而自溶，縮短產物的分泌期。發(fā)酵培養(yǎng)基一般選用含有快速和慢速利用的混合氮源，還要在發(fā)

23、酵過程中補加氮源來控制濃度。補加有機氮源，如酵母汁、玉米漿、尿素；補加無機氮源，如氨水或硫酸銨。,三、磷酸鹽濃度的影響和控制,菌體生長所允許的濃度比次級代謝產物合成所允許的濃度就大得多。對于初級代謝來說，要求不如次級代謝那樣嚴格。對抗生素發(fā)酵來說，常常是采用生長亞適量(對菌體生長不是最適合但又不影響生長的量)的磷酸鹽濃度,,總的來說，培養(yǎng)基過于豐富，會使菌生長過盛，發(fā)酵液非常黏稠，傳質狀況很差。細胞不得不花費許多能量來維持其生存環(huán)境

24、，即用于非生產的能量倍增，對產物的合成不利。除上述主要基質外，還有其它培養(yǎng)基成分影響發(fā)酵。如Cu2+，在以醋酸為碳源的培養(yǎng)基中，能促進谷氨酸產量的提高，Mn2+對芽孢桿菌合成桿菌肽等次級代謝產物具有特殊的作用，必須使用足夠的濃度才能促進它們的合成等。有關前體物質濃度的控制放在各論中進行討論。,第五節(jié)、溫度的影響及其控制,本節(jié)內容:一、溫度對發(fā)酵的影響二、影響發(fā)酵溫度變化的因素三、溫度的控制,一、溫度對發(fā)酵的影響,微生物藥品發(fā)酵所

25、用的菌體絕大多數是中溫菌，如霉菌、放線菌和一般細菌。它們的最適生長溫度一般在20～40℃。,,溫度的變化對發(fā)酵過程可產生兩方面的影響：一方面是影響細胞的各種代謝過程，包括各種酶反應的速率和蛋白質的性質另一方面是影響發(fā)酵液的物理性質。,,1.能改變菌體代謝產物的合成方向，溫度變化還對多組分次級代謝產物的組分比例產生影響2.影響碳源基質轉化為細胞的得率3.幾乎所有微生物的脂質成分均隨生長溫度變化4.影響發(fā)酵液的粘度、基質和氧在發(fā)酵

26、液中的溶解度和傳遞速率、某些基質的分解和吸收速率等,圖示：溫度對細胞得率和脂肪組分的影響,二、影響發(fā)酵溫度變化的因素,1、產熱因素：生物熱（Q生物）、攪拌熱（Q攪拌）2、散熱因素：蒸發(fā)熱（Q蒸發(fā)）、輻射熱（Q輻射）、顯熱（Q顯）3、發(fā)酵熱（Q發(fā)酵）是發(fā)酵溫度變化的主要因素。Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射－Q顯由于Q生物、Q蒸發(fā)和Q顯，特別是Q生物在發(fā)酵過程中隨時間變化，因此發(fā)酵熱在整個發(fā)酵過程中也隨時間變化，引起發(fā)酵

27、溫度發(fā)生波動。,三、溫度的控制,1、最適溫度的選擇在生長階段，應選擇最適生長溫度；在產物分泌階段，應選擇最適生產溫度。發(fā)酵溫度可根據不同菌種、不同產品進行選擇。,2、溫度的控制,工業(yè)生產上，所用的大發(fā)酵罐在發(fā)酵過程中一般不需要加熱，因發(fā)酵中釋放了大量的發(fā)酵熱，需要冷卻的情況較多。利用自動控制或手動調整的閥門，將冷卻水通入發(fā)酵罐的夾層或蛇行管中，通過熱交換來降溫，保持恒溫發(fā)酵。如果氣溫較高（特別是我國南方的夏季氣溫），冷卻水的溫

28、度又高，致使冷卻效果很差，達不到預定的溫度，就可采用冷凍鹽水進行循環(huán)式降溫，以迅速降到最適溫度。因此大工廠需要建立冷凍站，提高冷卻能力，以保證在正常溫度下進行發(fā)酵。,第六節(jié)、pH的影響及其控制,本節(jié)內容:一、pH對發(fā)酵的影響二、pH的變化三、發(fā)酵pH的確定和控制,一、pH對發(fā)酵的影響,1、影響酶的活性，當pH值抑制菌體中某些酶的活性時，會阻礙菌體的新陳代謝；2、影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細胞膜的通透性，影響微生物對營養(yǎng)

29、物的吸收和代謝產物的排泄；3、影響培養(yǎng)基中某些組分的解離，進而微生物對這些成分的吸收；4、pH值不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產物的質量和比例發(fā)生改變。,二、pH的變化,在發(fā)酵過程中，隨著菌種對培養(yǎng)基種碳、氮源的利用，隨著有機酸和氨基酸的積累，會使pH值產生一定的變化。1、生長階段：菌體產生蛋白酶水解培養(yǎng)基中的蛋白質，生成銨離子，使pH上升至堿性；隨著菌體量增多，銨離子的消耗也增多，另外糖利用過程中有機酸的積累使pH值下

30、降。2、生產階段：這個階段pH值趨于穩(wěn)定。3、自溶階段：隨著養(yǎng)分的耗盡，菌體蛋白酶的活躍，培養(yǎng)液中氨基氮增加，致使pH又上升，此時菌體趨于自溶而代謝活動終止。,,由此可見，在適合于菌生長及合成產物的環(huán)境條件下，菌體本身具有一定的調節(jié)pH的能力，但是當外界條件變化過于劇烈，菌體就失去了調節(jié)能力，培養(yǎng)液的pH就會波動 。,引起發(fā)酵液pH值異常波動的因素,1、pH下降：（1）培養(yǎng)基中碳、氮比例不當。碳源過多，特別是葡萄糖過量，或者中間補

31、糖過多加上溶氧不足，致使有機酸大量積累而pH下降；（2）消泡劑加得過多；（3）生理酸性物質的存在，銨被利用，pH下降。2、pH上升：（1）培養(yǎng)基中碳、氮比例不當。氮源過多，氨基氮釋放，使pH上升；（2）生理堿性物質存在；（3）中間補料氨水活尿素等堿性物質加入過多。,三、發(fā)酵pH的確定和控制,1、發(fā)酵pH值的確定 細菌和放線菌在6.5～7.5，酵母在4～5，霉菌在5～7生長，最適溫度高的菌種，其最適pH也相應高一些。

32、 最適pH值是根據實驗結果來確定的 。,實驗測定最適pH值的：,例如：將發(fā)酵培養(yǎng)基調節(jié)成不同的出發(fā)pH值，進行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中，定時測定和調節(jié)pH值，以分別維持出發(fā)pH值，或者利用緩沖液來配制培養(yǎng)基來維持 ，到時觀察菌體的生長情況，以菌體生長達到最高值的pH值為菌體生長的合適pH值。用同樣的方法，可測得產物合成的合適pH值。,2、pH值的控制,（1）首先考慮和試驗發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎配方，使它們有個適當的配比，使發(fā)酵過程中的pH

33、值變化在合適的范圍內。（2）在發(fā)酵過程中直接補加酸或堿和補料的方式來控制；補充生理酸性物質（如(NH4)2SO4）和生理堿性物質（如NaNO3）來控制。,第七節(jié)、溶氧的影響及其控制,本節(jié)內容:一、溶氧的影響二、發(fā)酵過程的溶氧變化三、溶氧濃度的控制,前言,在發(fā)酵過程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。工業(yè)發(fā)酵中產率是否受氧的限制，單憑通氣量的大小是難以確定的。因溶氧的高低不僅取決于供氧、通氣攪拌等，還取決于需氧狀況

34、。從溶氧變化的情況可以了解氧的供需規(guī)律及其對生長和產物合成的影響。常用的測氧方法主要是基于極譜原理的電流型測氧覆膜電極。,一、溶氧的影響,在發(fā)酵過程中，影響耗氧的因素有以下幾方面：1、培養(yǎng)基的成分和濃度2、菌齡3、發(fā)酵條件,二、發(fā)酵過程的溶氧變化,生長過程從培養(yǎng)液中溶氧濃度的變化可以反映菌的生長生理狀況 ：通常，在對數生長期溶氧明顯下降，從其下降的速率可估計菌的大致生長情況。,三、溶氧濃度的控制,在供氧方面，主要是設法提高氧傳遞

35、的推動力和液相體積氧傳遞系數。1、調節(jié)攪拌轉速或通氣速率來控制供氧；2、控制補料速度來控制基質的濃度，從而達到最適的菌體濃度，保證產物的比生長速率維持在最大值，又不會使需氧大于供氧。3、采用調節(jié)溫度（降低培養(yǎng)溫度可提高溶氧濃度）、液化培養(yǎng)基、中間補水、添加表面活性劑等工藝措施，來改善溶氧水平。,第八節(jié)、二氧化碳的影響及其控制,本節(jié)內容:一、二氧化碳的來源和影響二、二氧化碳濃度的控制,一、二氧化碳的來源和影響,1、 CO2來源：

36、 CO2是呼吸和分解代謝的終產物。幾乎所有酵均產生大量CO2，例如，在產黃青霉的生長產物形成中的CO2來源可用下式表示：菌體生長：,CO2來源,2. CO2的影響,(1) CO2對微生物生長的影響 CO2對微生物生長和發(fā)酵具有刺激或抑制作用，此現象稱為CO2效應。 CO2受限制可能導致適應(停滯)期的延長；菌絲形態(tài)隨CO2含量不同而改變。(2) CO2對產物合成的影響

37、 促進或抑制作用。即使供氧已足夠，還應考慮通氣量，需降低發(fā)酵液中CO2的濃度。(3) CO2對細胞的作用機制 CO2及HCO3都影響細胞膜的結構，改變膜的流動性及表面電荷密度，影響細胞膜的運輸效率，改變細胞形態(tài)。,二、二氧化碳濃度的控制,1、 CO2濃度大小受到菌體的呼吸強度、發(fā)酵液流變學特性、通氣攪拌程度和外界壓力大小等許多因素影響 罐內的CO2分壓是液體深度的函數，CO2的溶解度隨壓力增加而增大。2、CO2濃度的

38、控制應隨它對發(fā)酵的影響而定。通氣和攪拌速率的大小，能調節(jié)CO2的溶解度。3、CO2的產生與補料工藝控制密切相關。補糖會增加排氣中CO2的濃度和降低培養(yǎng)液的pH。4、在青霉素補料工藝的控制參數中，排氣中的CO2量的變化比pH變化更為敏感，所以采用CO2釋放率作為控制補糖的參數。,第九節(jié)、補料的作用和控制,本節(jié)內容:一、補料分批培養(yǎng)（FBC)的優(yōu)點和應用二、 FBC的作用三、 FBC的補料方式和控制,一、補料分批培養(yǎng)（FBC)的優(yōu)

39、點和應用,1、可以解除底物抑制、產物反饋抑制和分解代謝物的阻遏；2、可以避免在分批發(fā)酵中因一次投料過多造成細胞大量生長所引起的影響，改善發(fā)酵流變學的性質；3、可用作控制細胞質量的手段，以提高發(fā)芽孢子的比例；4、可作為理論研究的手段，為自動控制和最優(yōu)控制提供實驗基礎。,二、 FBC的作用,1、可以控制抑制性底物的濃度高濃度營養(yǎng)物對大多數微生物生長是不利的 ：滲透壓過高；熱致死 ；抑制細胞組分或酶；改變菌體的生化代謝2、可以解除或

40、減弱分解產物阻遏3、可以使發(fā)酵過程最佳化,三、 FBC的補料方式和控制,就補料方式而言：連續(xù)流加、不連續(xù)流加、多周期流加 每次流加又可分為：快速流加、恒速流加、指數速率流加、變速流加從反應器數目分類：單組分流加、多組分流加從反應器中發(fā)酵體積來分：有變體積和恒體積之分。從補加培養(yǎng)基的成分來分，又可分為單組分補料和多組分補料。,1、 補料的策略,優(yōu)化補料速率要根據微 生物對養(yǎng)分的消耗速率及所設定的發(fā)酵液中最低維持濃度而定。

41、不論生物反應器的體積傳質系數大小，它們均有一最佳補料速率，補糖速率的最佳點與KLα有關,2、 補料的依據和時機判斷,依據有：用菌的形態(tài)，比生長速率，發(fā)酵液中糖濃度，溶氧濃度，尾氣中的氧和CO2含量，攝氧率或呼吸商的變化。不同的發(fā)酵品種有不同的依據。一般以發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛葹橹笜?。對次級代謝產物的發(fā)酵，還原糖濃度一般控制在5g/L左右的水平。也有用產物的形成來控制補料。如現代酵母生產是藉自動測量尾氣中的微量乙醇來嚴格控制糖蜜的流加。,

42、幾種補料依據介紹-a,a. 糖濃度和溶氧濃度,青霉素補料發(fā)酵：可通過補料速率的調節(jié)來控制生長和氧耗，使菌處于半饑餓狀態(tài)，使發(fā)酵液有足夠的氧，從而達到高的青霉素生產速率。加糖可控制對數生長期和生產期的代謝。控制加糖速率使青霉素發(fā)酵處于半饑餓狀態(tài)對青霉素的合成有利。對數生長期采用計算機控制加糖來維持溶氧和pH在一定范圍內可顯著提高青霉素的產率。在青霉素發(fā)酵的生產期溶氧比pH對青霉素合成的影響更大，因在此期溶氧為控制因素。,幾種補料依據介

43、紹-b,b. 尾氣中CO2含量,在青霉素發(fā)酵中加糖會引起尾氣CO2含量的增加和發(fā)酵液的pH下降。糖、CO2、pH三者的相關性可作為青霉素工業(yè)生產上補料控制的參數。尾氣的變化比pH更為敏感，可測定尾氣CO2的釋放率來控制加糖速度。,幾種補料依據介紹-c,c. 比生長速率的影響以細胞體或初級代謝物為產物的發(fā)酵需要維持最大的μ來獲得最大產量。例如面包酵母培養(yǎng)期間維持最大的μ來獲得最大產量，同時避免糖濃度高時由于crabtree效應引起

44、乙醇的形成，導致發(fā)酵周期延長和產量降低?？捎闷咸烟莻鞲衅髟诰€監(jiān)控葡萄糖含量或監(jiān)控乙醇濃度和呼吸商(RQ)隨時間的延長，稀釋速率將隨體積的增加而減少，因而補料-分批發(fā)酵的μ是降低的 。在分批補料中為了維持最大μ值，常采用指數式補料。,Crabtree效應,Pasteur在研究酵母發(fā)酵時，發(fā)現在供氧充足的條件下，細胞內糖酵解作用受到抑制。葡萄糖消耗和乳酸生成減少，這種有氧氧化對糖酵解的抑制作用稱為巴士德效應(Pasteur effect)

45、。Crabtree效應與巴士德效應相反，在癌細胞研究中發(fā)現，給予葡萄糖時不論供氧充足與否，都呈現很強的酵解反應，而糖的有氧氧化受抑制，稱為Crabtree效應或反巴士德效應。這種現象較普遍地存在于癌細胞中，此外也存在于一些正常組織細胞如視網膜、睪丸、顆粒白細胞等。,3、補料的控制方法,1）、 反饋控制系統(tǒng)：由傳感器、控制器和驅動器組成。 分為直接方法和間接方法。 間接方法是以溶氧、pH、呼吸商、排氣中CO2分壓及代謝產物濃度等

46、作為控制參數。對間接方法來說，選擇與過程直接相關的可檢參數作為控制指標，是研究的關鍵。 直接方法是直接以限制性營養(yǎng)物(如碳源、氮源或C/N等)的濃度作為反饋控制的參數。直接方法，由于長期缺乏可靠的適時測定手段，無法控制適時補料，所以一直沒有用于發(fā)酵控制。,補料的控制方法-2）無反饋控制,無反饋控制指無固定的反饋控制參數來使操作最優(yōu)化的控制。過去是以經驗為基礎，后來才出現嚴格的數學模型。在頭孢菌素C的發(fā)酵研究中，采用計算機模擬的辦法

47、，考慮到菌絲的分化、產物的誘導及分解產物對產物合成的抑制等多種因素，利用歸一法原理，把復雜的多組分補料問題簡化成各個單一組分的補料，從而確立了最優(yōu)化的補料方式。經模擬試驗證實，采用該補料方式可比分批培養(yǎng)法的產量提高近30%。,第十節(jié)、泡沫的影響及其控制,本節(jié)內容:一、泡沫的產生及影響二、發(fā)酵過程中泡沫消長規(guī)律三、泡沫的控制,一、泡沫的產生及影響,泡沫是氣體被分散在少量液體中的膠體體系，氣液之間被一層液膜隔開，彼此不相連通。泡沫有兩

48、種類型：發(fā)酵液液面上的泡沫和發(fā)酵液中的泡沫，又稱流態(tài)泡沫(fluid foam)。發(fā)酵液的理化性質對形成泡沫的表面現象起決定性的作用：蛋白質和細胞本身具有穩(wěn)定泡沫的作用。,5種起泡的方式：,①整個發(fā)酵過程中，泡沫保持恒定的水平；②發(fā)酵早期，起泡后穩(wěn)定地下降，以后保持恒定；③發(fā)酵前期，泡沫稍微降低后又開始回升；④發(fā)酵開始起泡能力低，以后上升；⑤以上類型的綜合方式。這些方式的出現是與基質的種類、通氣攪拌強度和滅菌條件等因素有關。

49、其中基質中的有機氮源(如黃豆餅粉等)是起泡的主要因素。,起泡給發(fā)酵帶來的副作用：,①降低了發(fā)酵罐的裝料系數②增加了菌群的非均一性③增加了污染雜菌的機會④大量起泡，會引起逃液⑤影響通氣攪拌，菌體呼吸受到阻礙⑥消泡劑的加入有時會影響發(fā)酵或給提煉工序帶來麻煩。,二、發(fā)酵過程中泡沫消長規(guī)律,發(fā)酵過程中泡沫的多寡與通氣攪拌的劇烈程度和培養(yǎng)基的成分有關： 蛋白、黏度 、糖類 、滅菌在發(fā)酵過程中發(fā)酵液的性質隨菌的代謝活動不斷變化，是泡沫消

50、長的重要因素。,霉菌發(fā)酵過程中液體表面性質與泡沫壽命的關系,三、泡沫的控制,兩種途徑：①調整培養(yǎng)基中的成分，或改變某些物理化學參數 ，或者改變發(fā)酵工藝 ；②采用機械消沫或消沫劑消沫 從生產菌種本身的特性著手，預防泡沫的形成。,1、機械消沫,利用機械強烈振動或壓力變化而使泡沫破裂，起消沫作用。有罐內消沫和罐外消沫兩種方法。該法的優(yōu)點是：節(jié)省原料，不需引進外界物質(如消泡劑)，減少染菌機會，不會增加下游工段的負擔。消沫效果不理想，

51、不能從根本上消除泡沫成因，僅可作為消沫的輔助方法。,2、消沫劑消沫,1）、消沫劑的作用 利用外界加入消沫劑，使泡沫破裂。消沫劑的作用，或者是降低泡沫液膜的機械強度，或者是降低液膜的表面粘度，或者兼有兩者的作用，達到破裂泡沫的目的。 消沫劑都是表面活性劑，具有較低的表面張力。 應具備的條件：親水性 、大活性、持久 、無毒性 、不影響提取、無危害、成本低 、不影響氧傳遞；耐高溫。,2）、消泡劑的種類,常用的消沫劑，主要有天然油脂類，高

52、碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類，硅酮類4大類。天然油酯類和聚醚類在微生物藥物發(fā)酵中最為常用 。,3）、消沫劑的應用,消沫劑多數是溶解度小、分散性不十分好的高(大)分子化合物，要考慮如何降低它的粘度和提高它的分散性增效方法：①加分散劑增效；②消沫劑的并用增效消沫作用的持久性還與加入量和時機有關注意消沫劑對微生物的影響應制成乳濁液，宜與機械方法聯合,應用消泡劑時的增效方法：,加載體增效：即用惰性載體（如礦物油、植物油等）使消泡劑溶解分散

53、，達到增效的目的；消泡劑并用增效：取各種消泡劑的優(yōu)點進行互補，達到增效（如GP和GPE 1:1混合使用于土霉素發(fā)酵，結果比單獨使用GP的效力提高2倍）；乳化消泡劑增效：用乳化劑（或分散劑）將消泡劑制成乳劑，以提高分散能力，增強消泡效力（如用吐溫-80制成的乳劑，用于慶大霉素發(fā)酵，效力提高1～2倍），一般只適用于親水性差的消泡劑。在生產過程中，消泡的效果除了與消泡劑的種類、性質、分子量大小、消泡劑親油親水基團等密切香港外，還與消泡劑

54、使用時加入方法、使用濃度、溫度等有很大關系，應結合生產實際加以注意和解決,第十一節(jié)、發(fā)酵終點的判斷,本節(jié)內容:如何確定合理的放罐時間？要確定一個合理的放罐時間，須考慮哪些因素？,如何確定合理的放罐時間？,必須把追求高生產力和顧及產品的成本二者結合起來到了末期，菌體的分泌能力都要下降，菌體衰老而進入自溶，釋放出體內的分解酶會破壞已形成的產物。所以必須確定合適的發(fā)酵終點。發(fā)酵類型的不同，要求達到的目標也不同：區(qū)別對待原材料與發(fā)酵成本

55、占整個生產成本的主要部分 ，下游提煉成本占主要部分和產品價值高這幾種不同情況,要確定一個合理的放罐時間，須考慮以下因素：,一、經濟因素 以最低的成本來獲得最大生產能力的時間為最適發(fā)酵時間。二、產品質量因素 發(fā)酵工藝長短對后續(xù)工藝和產品質量有很大影響三、特殊因素 1、在正常情況下，可根據作業(yè)計劃，按時放罐； 2、在異常情況下，如染菌、代謝異常（糖耗緩慢等），就應根據不同情況，進行適當處理，以免倒罐。