協(xié)和醫(yī)科大學考博分子生物學精選

1、重要實驗 重要實驗1、RNA 酶保護實驗（RNase protection assay）：它在許多方面與 S1 核酸酶分析方法類似。它是用人工合成的具 35S 或 32P 標記的反義 RNA 探針同目的 mRNA 雜交，所形成的雙鏈體分子用只切割單鏈的 RNaseA 和 RNaseT1 消化，之后將仍保留著的 RNA 做大小分部分離，于是被保護的 RNA 探針便給出了在樣品中存在的目的 mRNA 的大小數值。此法同樣可鑒定樣品中 mRN

2、A 的數量。2、DNA 酶足跡法（DNase footprinting）：也叫足跡實驗（footprinting assay） ，是一種用來檢測被特定蛋白特異性結合的 DNA 序列的位置及其核苷酸序列結構特征的實驗方法。基本原理：當 DNA 分子中的某一區(qū)段同特異蛋白結合之后，便會得到保護而免受 DNaseⅠ的切割作用，結果不會產生出相應長度的切割分子，于是在凝膠電泳放射自顯影圖片上便會出現一個空白區(qū)，俗稱“足跡” 。通過與沒有蛋白保護

3、的對照 DNA 序列比較，便可得知相應于足跡部位的核苷酸序列結構。3、S1 核酸酶定位法（nuclease S1 mapping）：用于揭示 mRNA 序列結構特征的一種技術。將從一個克隆基因分離的經放射性標記的單鏈 DNA 片段同其相應的 mRNA 退火形成雙鏈分子，然后用 S1 核酸酶消化此雜合分子上未互補配對的單鏈序列，再用 PAGE 及放射自顯影方法，檢測保留下來的 DNA片段的分子大小。此法可測定克隆基因中的內含子數目及大體位

4、置，mRNA 分子的 5’端位置及mRNA5’端任何不均一性的程度。4、染色體步移（chromosome walking）：借助反向 PCR（inverse PCR）通過使部分序列已知的限制片段自身環(huán)化連接，然后在已知序列部位設計一對反向引物，經 PCR 而使未知序列得到擴增。重復進行反向 PCR，從染色體已知序列出發(fā)，逐步擴增出未知序列，稱染色體步移。5、凝膠阻滯實驗（gel retardation assay）：又叫 DNA 遷移率

5、變動實驗（DNA mobility shift assay） ，或電泳遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA） ，或條帶阻滯實驗（band retardation assay） 。它是根據裸露的 DNA 與結合有某種蛋白的相同大小的 DNA 在電泳中具有不同的遷移率（DNA-protein 復合物由于具有較高的分子量，因此通過凝膠的速度要比裸露的 DNA 緩慢）這一原理，在

6、20 世紀 80 年代初期設計出來的用于檢測與特定 DNA 片段相結合的特定蛋白的一種實驗技術。目前也可用于 RNA 結合 protein 的研究。6、甲基化干擾實驗（methylation interference assay）：根據 DMA 能使 G 殘基甲基化，而六氫吡啶又能特異地切割甲基化的 G 殘基這一原理設計的，用于研究 protein 與 DNA 相互作用的一種有效的辦法。7、Western blotting：即蛋白質印跡

7、（protein blotting） ，是用來檢測在不均一的蛋白質樣品中，是否存在目標蛋白質的一種技術。其操作程序與 Southern blotting 十分類似。先將蛋白質作變性 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉移到諸如硝酸纖維素濾膜一類的固體支持物上，通過專一性抗體探測目標蛋白質。隨后再用一種標記的第二抗體（如 125I 標記的或生物素化的羊抗兔的 IgG）檢測在印記中存在的免疫復合物（即第一抗體與抗原復合物） 。由于本法是在

8、變性和還原條件下進行凝膠電泳，因此目標蛋白質的分子大小是可被檢測出的。名詞解釋一 名詞解釋一1、小分子 G 蛋白：單體蛋白，分子量 20-30kD，與一般 G 蛋白 α 亞基有高度同源性并具有相似性，同時與 Ras 蛋白具有較高同源性，又稱為 Ras 超家族，分為 Ras、Rho、Arf、Sar、Ran、Rab 六個亞家族，參與多種信號傳遞途徑。其中 Ras 蛋白是細胞增殖與分化的關鍵調節(jié)因子，其基因的突變與許多人類腫瘤有關。2、大分子

9、 G 蛋白（鳥苷酸結合蛋白（guanine nucleotide binding protein，簡稱 G 蛋白） ）：G 蛋白是一類和 GTP 或 GDP 相結合、位于細胞膜胞漿面的外周蛋白，由三個亞基組成。他們是 α 亞基（45KD） 、β 亞基（35KD）和 γ 亞基（7KD） 。G 蛋白有兩種構象，一種以 αβγ 三聚體存在并與 GDP結合，為非活化型；另一種構象是 α 亞基與 GTP 結合并導致 βγ 二聚體的脫落，此型為活化

10、型。功能：1、調節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性；2、調節(jié)視網膜 cGMP 磷酸二酯酶活性。3、調節(jié)磷脂酶 C 活性，促進 IP3與 DG 的生成；4、調節(jié)離子通道。類似機制至少出現在六個 E. coli 操縱子中，它們編碼的酶均參與 Aa 的合成。13、DNA 的體外重組：DNA 的體外重組是指含有特異目的基因的 DNA 片段與載體 DNA 在試管內連接的過程。常用的方法：1、粘性末端連接法；2、平末端連接法；3、結尾法；4、人工接頭法（linke

11、r） 。14、 “自殺基因”的基因治療：也稱活化前體藥物性基因治療。某些病毒或細菌產生的酶能將對人體無毒或低毒的藥物前體，在人體細胞內一系列酶的催化下轉變?yōu)榧毎拘晕镔|，從而導致細胞死亡。15、限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）：是一類特異性地水解雙鏈（ds）的 DNA 的磷酸二酯酶。分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。內切酶的用途：1、制作 DNA 物理圖譜；2、DNA 限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLPS） 。3、基因

12、克隆及亞克?。?、DNA 雜交與序列分析；5、基因組同源性研究；6、基因突變和化學修飾的研究。16、感受態(tài)細胞（copetent cell）：理化方法誘導細胞，使其處于最適攝取和容納外來 DNA 的生理狀態(tài)。17、單順反子（monocistron）：真核基因轉錄產物為單順反子，即一個基因編碼一條多肽鏈或 RNA鏈，每個基因轉錄有各自的調節(jié)元件。18、包裝細胞（pakaging cell）：包裝細胞是通過基因工程技術對細胞進行修飾，使其產

13、生病毒結構基因 gag、pol、env 所編碼的蛋白，為逆轉錄病毒載體包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白，同時，該包裝細胞并不能轉錄產生編碼完整病毒的基因組 RNA，一句話，包裝細胞本身不能產生任何形式的病毒顆粒。19、基因敲除(gene knockout)：將細胞基因組的某一序列克隆并加以改造后重新導入細胞中，這一序列就可以與基因組內的同源序列發(fā)生重組，從而將改造后的基因置換到基因組內，實現基因的定位突變?？梢杂谜；蚯贸蛔兊幕?/p>

14、，以進行性狀的改良和遺傳病的治療，又可以用突變的基因敲除正常的基因，以研究此基因在發(fā)育和調控方面的作用。Gene knockout，基因敲除，定向敲除，基因敲除小鼠。Gene knockin，基因敲入，定向替代，插入到無關基因的地方，基因整合，基因重組小鼠。20、基因打靶（gene targeting）：有些生物，例如釀酒酵母，通過轉化后細胞中發(fā)生的外源 DNA 與核基因組 DNA 之間的同源重組，可使外源基因插入到特定的染色體位置，此

15、過程叫基因打靶，有時也叫基因置換（transplacement） 。應用此技術，我們能夠將體外修飾改造的突變基因或是某種新的基因，取代特定的染色體基因，從而在生物活體內研究此基因的功能。21、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP）限制性片段長度多態(tài)性，人類第一代遺傳標記。當用限制性內切酶切割不同品種或個體的基因組 DNA 時，如果限制性內切酶的酶切位點的堿基發(fā)生突變，或者

16、酶切位點之間 DNA 片段發(fā)生堿基的插入或缺失，導致酶切片斷的大小、數量發(fā)生了變化，產生相當多的數目和大小不等的 DNA 片段。這種變化可以通過特定的探針雜交進行檢測，從而可以比較不同品種或個體之間的 DNA 水平的差異（或多態(tài)性）。廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物的進化和分類關系研究。22、RAPD（Random Amplified Polymorphism DNA， RAPD）隨機擴增多態(tài)性 DNA，利用隨即引物擴增尋找

17、多態(tài)性 DNA 片段的分子標記方法。是建立在 PCR 技術基礎上，利用一系列（通常數百）不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈（一般為 10bp）為引物，對所研究的基因組 DNA 進行 PCR擴增，然后用凝膠電泳分開擴增片段，EB 等染色劑染色后檢測擴增產物 DNA 片段的多態(tài)性。與 RAPD技術相類似的還有 AP-PCR（Arbitrary Primed PCR，任意引物 PCR）和 DAF（DNA Amplified Fingerp

18、rints）2 種標記技術。在 AP-PCR 分析中，引物長度與常規(guī) PCR 相當，但退火溫度較低，允許大量錯配，引發(fā)具有隨機性質的擴增。所使用的引物較長（通常 10～50bp），擴增分為 3 個部分，每個部分要求的條件和組分的濃度存在差異。DAF 是一種改進的 RAPD 分析技術，與 RAPD 技術不同的是它使用引物濃度更高，長度更短（一般 5～8bp），只有 2 個溫度循環(huán)，并常用聚丙烯酰胺凝膠電泳，所提供譜帶信息比 RAPD 大得

19、多。三者合稱任意擴增多帶譜。23、AFLP（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）擴增片段長度多態(tài)性，AFLP 是RFLP 和 PCR 結合的產物，其基本原理是：將基因組 DNA 進行限制性內切酶酶切，然后選擇特定的片段進行 PCR 擴增，使用雙鏈人工“接頭”與基因組 DNA 的酶切片段相連接作為擴增反應模板，“接頭”與“接頭”相鄰的酶切片段的幾個堿基序列作為引物的結合位點。這樣就只有那