小麥漸滲系SR4堿脅迫應(yīng)答基因TaCCD1和TaStpk-B的功能研究.pdf

1、植物所受到的堿脅迫是由土壤中的Na2CO3和NaHCO3所造成的。與鹽脅迫相比，植物受到的堿脅迫的損傷程度更為嚴(yán)重。這是因?yàn)閴A脅迫除了離子和滲透脅迫，還包含高pH脅迫。至今，人們?cè)谥参锬望}機(jī)制研究方面較為廣泛而深入，但是對(duì)植物的堿脅迫響應(yīng)機(jī)制卻研究較少，亟待加強(qiáng)。
　　山融4號(hào)（Shanrong No.4簡(jiǎn)稱SR4）是本實(shí)驗(yàn)室利用不對(duì)稱體細(xì)胞雜交技術(shù)將長(zhǎng)穗偃麥草的染色質(zhì)漸滲到普通小麥濟(jì)南177中獲得的小麥耐鹽堿新品系。前期通過(guò)大田

2、及鹽堿池種植實(shí)驗(yàn)均證明SR4具有很強(qiáng)的抗堿特性并且利用第二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析小麥山融4號(hào)根系堿脅迫響應(yīng)基因，從中篩選出TaCCD1和TaStpk-B進(jìn)行功能鑒定。
　　1.SR4鈣離子結(jié)合蛋白TaCCD1的功能研究
　　我們以SR4的cDNA為模板克隆到了一個(gè)約600 bp的TaCCD1的開(kāi)放閱讀框。它編碼一種含有EF手型基序motif的鈣離子結(jié)合蛋白。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明:TaCCD1定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。qRT-PCR分

3、析實(shí)驗(yàn)表明，TaCCD1在不同的脅迫處理?xiàng)l件下表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。通過(guò)浸花法將TaCCD1轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，篩選出兩個(gè)表達(dá)量較高的TaCCD1過(guò)表達(dá)純系進(jìn)行耐逆相關(guān)研究。在堿脅迫處理?xiàng)l件下，TaCCD1 OE系的根較對(duì)照Col-0長(zhǎng)，表明TaCCD1OE系對(duì)于堿脅迫具有抗性。之后的堿脅迫處理萌發(fā)實(shí)驗(yàn)表明TaCCD1 OE系的子葉綠化程度較Col-0高，表現(xiàn)出對(duì)堿脅迫的抗性。葉綠素含量測(cè)定結(jié)果證明:在經(jīng)堿pH處理之后，野生型植株的葉綠素

4、含量低于過(guò)表達(dá)植株。上述實(shí)驗(yàn)均證明TaCCD1可以促進(jìn)植物對(duì)于堿脅迫的抗性。在ABA脅迫處理?xiàng)l件下，TaCCD1 OE的根較Col-0長(zhǎng)，表明TaCCD1增強(qiáng)了植物對(duì)于ABA的抗性。在鹽脅迫處理?xiàng)l件下，TaCCD1 OE的根較Col-0長(zhǎng)，表明TaCCD1增強(qiáng)了植物對(duì)于鹽脅迫的抗性。在H2O2脅迫處理?xiàng)l件下，TaCCD1 OE的側(cè)根數(shù)目較Col-0多，表明TaCCD1增強(qiáng)了植物對(duì)于氧化脅迫的抗性。TaCCD1 OE系體內(nèi)的ROS含量較C

5、ol-0低，且TaCCD1 OE系有較高水平的ROS清除酶活性。進(jìn)一步分析，證實(shí)了依賴ABA的脅迫應(yīng)答基因MYB2、RAB18、RD29B在TaCCD1 OE系中有所上調(diào)，ABA信號(hào)通路的正調(diào)控因子ABI5表達(dá)量下調(diào);而不依賴ABA的脅迫應(yīng)答基因DREB2A表達(dá)量上調(diào)。離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)基因SOS2和HKT表達(dá)量上調(diào)。在堿處理?xiàng)l件下，葉綠素合成相關(guān)的基因HEMF2，HEME2，HEMB2，HEME1，CRD1，GSA1，PORA，PORB

6、較Col-0出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而葉綠素分解基因SGR沒(méi)有明顯變化。綜上所述，TaCCD1可以通過(guò)調(diào)控ROS的積累及鈉離子的轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)植物對(duì)堿脅迫、鹽脅迫和氧化脅迫等非生物脅迫的抗性，且這些抗性可能是通過(guò)調(diào)控ABA信號(hào)通路來(lái)起作用的。此外，TaCCD1通過(guò)正調(diào)控葉綠素合成基因的表達(dá)賦予過(guò)表達(dá)植株堿抗性。
　　2.耐鹽堿小麥漸滲系SR4 TaStpk-B的研究
　　我們從SR4中克隆到了一個(gè)約1.2 kb的TaStpk-B的開(kāi)放閱讀框

7、。TaStpk-B編碼的產(chǎn)物是含有Ser/Thr保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明:TaStpk-B定位于細(xì)胞質(zhì)中。qRT-PCR分析實(shí)驗(yàn)表明，該基因在不同的脅迫處理?xiàng)l件下表現(xiàn)出不一樣的表達(dá)模式。通過(guò)浸花法將TaStpk-B轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，篩選出兩個(gè)表達(dá)量較高的TaStpk-B過(guò)表達(dá)純系進(jìn)行耐逆相關(guān)研究。在堿脅迫處理?xiàng)l件下，TaStpk-B OE系的根較對(duì)照Col-0長(zhǎng)，表明TaStpk-B OE系對(duì)于堿脅迫具有抗性。在NaCl及

8、甘露醇脅迫處理?xiàng)l件下，TaStpk-B OE系的根較Col-0短，表明TaStpk-BOE系植株對(duì)于NaCl及甘露醇敏感。TaStpk-B OE系體內(nèi)的ROS含量較Col-0低，且TaStpk-B OE系有較高水平的ROS清除酶活性。TaStpk-B OE體內(nèi)離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體類基因在TaStpk-B OE和對(duì)照植物中沒(méi)有明顯差別。在鹽處理?xiàng)l件下，過(guò)表達(dá)系的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸較野生型低。TaStpk-B使得ABA合成的關(guān)鍵基因ABA2顯著上調(diào)

9、表達(dá)，依賴于ABA信號(hào)通路的調(diào)控因子ABI3，ABI4顯著下調(diào)表達(dá)，不依賴于ABA信號(hào)通路的Marker基因RD29A顯著下調(diào)表達(dá)。綜上所述，TaStpk-B可以通過(guò)調(diào)控ROS的積累來(lái)應(yīng)對(duì)植物所遭受到的堿脅迫，且過(guò)表達(dá)植物所獲得的堿脅迫抗性可能是通過(guò)促進(jìn)正調(diào)控ABA合成途徑以及負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子來(lái)起作用的。而TaStpk-B反向控制不依賴于ABA信號(hào)通路的脅迫響應(yīng)RD29A，從而給予過(guò)表達(dá)植株的鹽敏感以及滲透敏感性。此外，