DNA甲基化對小麥鹽脅迫應(yīng)答基因的影響研究.pdf

1、作為全球三大糧食作物之一，小麥供養(yǎng)著30％以上的世界人口。而隨著全球氣候變暖、海平面上升、環(huán)境污染加重和城市化進(jìn)程加速，土壤鹽漬化這一現(xiàn)象日益嚴(yán)重，業(yè)已成為限制全球小麥產(chǎn)量的重要因素。
　　DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種，在植物體內(nèi)具有重要的作用。一方面，DNA甲基化通過沉默轉(zhuǎn)座子等功能來維持植物基因組的穩(wěn)定性，遠(yuǎn)緣雜交、異源多倍體化等引起的基因組沖擊可以導(dǎo)致DNA甲基化的重塑;另一方面，DNA甲基化可以調(diào)控植物功能基因的表達(dá)，

2、尤其是植物遭遇鹽、旱等非生物脅迫時，非生物脅迫應(yīng)答基因的DNA甲基化狀態(tài)迅速發(fā)生動態(tài)變化，實現(xiàn)應(yīng)答基因表達(dá)的誘導(dǎo)或者抑制。
　　本研究從本實驗室前期通過體細(xì)胞雜交創(chuàng)制的耐鹽小麥漸滲系品種山融3號出發(fā)，對比其親本普通六倍體小麥品種濟(jì)南177，證實了小麥鹽脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)受到其啟動子區(qū)域的DNA甲基化修飾調(diào)控，并發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞雜交過程的基因組沖擊可以導(dǎo)致小麥DNA甲基化的重塑，這種重塑對于山融3號的耐鹽性狀具有一定的意義。同時，鑒定出

3、小麥中5個表達(dá)受DNA甲基化調(diào)控的鹽脅迫應(yīng)答基因，并在擬南芥和小麥中初步證實了這些基因?qū)τ谥参镯憫?yīng)鹽脅迫的作用。進(jìn)一步的，從遺傳變異、DNA甲基化變異、表達(dá)差異和蛋白功能差異等角度詳細(xì)闡釋了小麥耐鹽關(guān)鍵基因HKT1;5不同染色體組上部分同源基因的進(jìn)化命運(yùn)。
　　1小麥漸滲系鹽脅迫應(yīng)答基因的DNA甲基化修飾調(diào)控研究
　　通過HPLC和MSAP實驗的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)小麥在受到鹽脅迫時，全基因組水平的DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生重塑。進(jìn)一步

4、利用亞硫酸鹽法對小麥中24個鹽脅迫應(yīng)答基因進(jìn)行DNA甲基化測序掃描發(fā)現(xiàn)，編碼區(qū)的胞嘧啶甲基化幾乎全部存在于CpG位點(diǎn)，鹽處理后這些位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)變化與基因表達(dá)的變化沒有明顯的對應(yīng)關(guān)系。對于只在編碼區(qū)存在甲基化修飾的基因，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-azaC處理之后，這些基因編碼區(qū)發(fā)生顯著的去甲基化現(xiàn)象，但是其表達(dá)并沒有發(fā)生變化，說明小麥中編碼區(qū)DNA甲基化對于基因表達(dá)的調(diào)控作用不顯著。統(tǒng)計分析顯示，小麥中基因啟動子區(qū)域的甲基化不僅存在于

5、CpG位點(diǎn)，在CpNpG和CpNpN位點(diǎn)也有一定比例的存在。鹽處理后，啟動子區(qū)域胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)發(fā)生變化，這種變化與對應(yīng)基因的表達(dá)呈現(xiàn)“去甲基化-基因表達(dá)上調(diào)，超甲基化-基因表達(dá)下調(diào)”的規(guī)律。進(jìn)一步用5-azaC處理，顯示啟動子區(qū)域發(fā)生顯著的去甲基化現(xiàn)象，對應(yīng)基因的表達(dá)被顯著的誘導(dǎo)，說明小麥中基因啟動子區(qū)域DNA甲基化對于基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。
　　雖然HPLC分析顯示體細(xì)胞雜交漸滲系小麥SR3與其母本JN177全基因組整

6、體水平上DNA甲基化修飾比率基本相同，但是MSAP實驗堿基水平顯示SR3與JN177之間許多胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)是不同的。更高分辨率的亞硫酸鹽測序數(shù)據(jù)表明，有21個胞嘧啶位點(diǎn)只在JN177中存在甲基化修飾，有10個位點(diǎn)則只在SR3中存在甲基化修飾。這些數(shù)據(jù)說明體細(xì)胞雜交過程中引起的基因組沖擊可以導(dǎo)致小麥DNA甲基化的重塑。進(jìn)一步分析表明，這種DNA甲基化的重塑對于SR3的耐鹽表型具有一定的意義。MSAP數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，對照情況下的SR3

7、與鹽脅迫下的JN177有13個位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)是一致的，這使得SR3中這些位點(diǎn)的DNA甲基化模擬了部分小麥鹽脅迫的響應(yīng)狀態(tài)，從而導(dǎo)致SR3可以更加快速地應(yīng)答鹽脅迫。更有趣的是，通過亞硫酸鹽測序，發(fā)現(xiàn)SR3和JN177之間一些基因啟動子區(qū)域的甲基化水平存在差異，而且這種差異還與相應(yīng)基因在SR3和JN177之間的差異表達(dá)也存在一定的對應(yīng)關(guān)系。
　　2小麥TaCYP81的克隆與耐鹽功能初步研究
　　從上部分內(nèi)容出發(fā)，發(fā)掘了一個受啟

8、動子區(qū)域DNA甲基化調(diào)控而在SR3與JN177中鹽脅迫下表達(dá)模式存在差異的小麥TaCYP81基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TaCYP81不僅在基因表達(dá)上受到鹽脅迫、過氧化氫脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而且其蛋白也受到鹽脅迫和過氧化氫脅迫影響而快速聚集到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這與前人發(fā)現(xiàn)的擬南芥、水稻、大豆、苜蓿等植物中此家族基因受到非生物脅迫時誘導(dǎo)表達(dá)的研究結(jié)果是一致的。將該基因在擬南芥中異源表達(dá)和在小麥中過表達(dá)，可以顯著提高擬南芥和小麥的耐鹽性。同時，發(fā)現(xiàn)TaCYP

9、81還可以降低擬南芥對于過氧化氫脅迫的敏感性。進(jìn)一步的生理實驗和擬南芥ROS清除酶實時定量PCR結(jié)果顯示，TaCYP81可以促進(jìn)擬南芥的ROS清除能力，推測TaCYP81提高小麥和擬南芥的耐鹽性的功能與其促進(jìn)植物ROS清除能力有關(guān)，需要進(jìn)一步的實驗驗證。
　　3小麥耐鹽關(guān)鍵基因HKT1;5不同染色體上部分同源基因的進(jìn)化研究
　　在第一部分研究過程中，發(fā)現(xiàn)對TaHKT1;5亞硫酸鹽測序時總是可以得到兩個部分同源的序列樣本，且兩

10、種序列樣本的DNA甲基化狀態(tài)存在顯著性差異，進(jìn)一步從遺傳變異、表觀遺傳變異、表達(dá)差異和蛋白結(jié)構(gòu)功能差異等角度，證實了小麥不同拷貝HKT1;5基因的不同進(jìn)化命運(yùn):(1) HKT1;5-A只在小麥二倍體祖先近緣種T.monococcum中存在，也是T.monococcum的耐鹽主效基因，推測進(jìn)化過程中由于4AL和5AL的染色體易位等原因而在四倍體小麥和六倍體小麥中丟失;(2) HKT1;5-B1在二倍體小麥祖先種的根中正常表達(dá)，進(jìn)化過程中雖

11、然基因序列幾乎沒有發(fā)生變化，但是在四倍體小麥和六倍體小麥的根中由于DNA超甲基化而呈現(xiàn)低表達(dá);(3) HKT1;5-B2在二倍體小麥祖先種的根中正常表達(dá)，但是在進(jìn)化過程中由于啟動子區(qū)域的重復(fù)序列插入，而在四倍體小麥和六倍體小麥中呈現(xiàn)超低表達(dá);(4) HKT1;5-B3在進(jìn)化過程中由于編碼區(qū)的大片段插入而在四倍體和倍體小麥中成為假基因;(5) HKT1;5-D在六倍體面包小麥中為耐鹽座位Kna1的主效候選基因，其基因序列在二倍體小麥祖先種

12、和六倍體小麥之間幾乎沒有差異，其表達(dá)量在二倍體小麥祖先種的根中相對六倍體小麥要高2倍左右，但是HKT1;5-D在根中不受DNA甲基化調(diào)控。
　　通過3D蛋白結(jié)構(gòu)模型預(yù)測和酵母突變體互補(bǔ)實驗，證實HKT1;5-B1也是具有鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的通道蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)能力略低于TmHKT1;5和TaHKT1;5-D。但是如前所述，HKT1;5-B1在四倍體小麥和六倍體小麥的根中因為DNA超甲基化而呈現(xiàn)低量表達(dá)，故其在小麥耐鹽性的貢獻(xiàn)上一直沒有受到重