基于潘那利番茄漸滲系發(fā)掘干旱脅迫響應(yīng)基因及功能分析.pdf

1、番茄(Solanum lycopersicum)為世界性重要蔬菜之一,在我國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)中具有重要地位,同時(shí)也是生物學(xué)模式生物之一。干旱直接威脅著番茄植株的生長(zhǎng)發(fā)育,導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。如何提高番茄自身的抗旱能力,培育優(yōu)良耐旱新品種,已成為迫切需要解決的問題。
　　 對(duì)植物耐旱機(jī)理的解析,前人已從生理生化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及分子等水平進(jìn)行了大量研究,并取得重要進(jìn)展。植物主要通過(guò)增厚表皮蠟質(zhì)層、改變氣孔開度、形成發(fā)達(dá)根系和貯水組織等結(jié)構(gòu)適應(yīng)干

2、旱；滲透調(diào)節(jié)物的形成、保護(hù)酶活性的提高、膜系統(tǒng)穩(wěn)定性的維持、內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)、次生代謝物的合成等生理生化代謝都參與植物對(duì)干旱的防御；對(duì)植物耐旱的分子機(jī)理研究,近年已克隆了一大批耐旱相關(guān)基因,在植物抵御干旱過(guò)程中起直接保護(hù)或調(diào)控作用。干旱等逆境下,植物體內(nèi)受ABA調(diào)控與非依賴ABA調(diào)控基因之間互作,形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),共同調(diào)節(jié)多條信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子活性,激發(fā)下游基因表達(dá),對(duì)干旱做出響應(yīng)。
　　 本研究以耐旱野生番茄S.pennelli

3、i與栽培番茄種S.lycopersicum cv M82及由二者構(gòu)建的一套漸滲系為研究材料,從形態(tài)結(jié)構(gòu)特征,分析耐旱番茄的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；通過(guò)生理生化指標(biāo)與耐旱性的相關(guān)性,建立適合耐旱番茄篩選的鑒定指標(biāo)；利用microarray技術(shù),從轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞分化等生物進(jìn)程,分析番茄響應(yīng)干旱的調(diào)控機(jī)理,候選耐旱相關(guān)基因,進(jìn)行功能驗(yàn)證,為番茄的耐旱性改良和耐旱機(jī)理分析提供重要理論指導(dǎo)和實(shí)踐依據(jù)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.耐旱番茄的形

4、態(tài)特性分析。通過(guò)對(duì)耐旱野生番茄S.pennelli與普通栽培種番茄S.lycopersicum M82形態(tài)結(jié)構(gòu)的比較,分析S.pennellii的耐旱結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。S.pennellii植株葉、莖及花萼等地上組織全部被濃密表皮毛和粘稠腺體分泌物覆蓋,利于減少水分散失的同時(shí)可能又有助于吸收空氣中的水分；葉上表皮氣孔數(shù)目較多,可以為吸收粘附在表皮的“露水”進(jìn)入體內(nèi)提供通道；葉片表皮細(xì)胞排列致密,也有利于減少體內(nèi)水分散失；柵欄組織與海綿組織之比變

5、大,可以增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度；莖中薄壁組織發(fā)達(dá),可能儲(chǔ)藏大量水分,供應(yīng)干旱等逆境下生長(zhǎng)所需；而欠發(fā)達(dá)的根系和葉脈等組織則在S.pennellii耐旱機(jī)理中發(fā)揮并不重要的作用。
　　 2.建立番茄耐旱評(píng)價(jià)指標(biāo)體系。通過(guò)對(duì)葉片相對(duì)含水量、細(xì)胞傷害率、丙二醛含量、超氧化物岐化酶含量、脯氨酸含量等生理生化指標(biāo)與耐旱性之間的相關(guān)性分析,建立適合耐旱性番茄篩選的檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果表明,輕度、中度、重度干旱脅迫下,葉片相對(duì)含水量都可用于鑒定番茄材料的耐旱

6、性。
　　 3.番茄干旱響應(yīng)基因分析。利用篩選的耐旱漸滲系與M82,結(jié)合microarray技術(shù),分析番茄響應(yīng)干旱的調(diào)控機(jī)理。每種參試材料都獲得超過(guò)1,200個(gè)差異表達(dá)基因,其中耐旱系中有359個(gè)單獨(dú)表達(dá)基因。通過(guò)生物學(xué)進(jìn)程分析,表達(dá)基因在逆境響應(yīng)中占主要比例。耐旱系可能通過(guò)特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因(編碼Zinc-finger、NAC、bHLH、AP2/EREBP及HSF等家族蛋白)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因(編碼受體蛋白激酶、促細(xì)胞分裂活性

7、蛋白激酶、鈣調(diào)結(jié)合蛋白、磷酸酯酶及膜蛋白等)、組織生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因和一系列單獨(dú)變化的生化途徑(糖異生、色氨酸降解、嘌呤核苷酸生成、過(guò)氧化物清除、淀粉降解、甲硫氨酸合成)等方式調(diào)節(jié)耐旱性。而耐旱系和M82中共同表達(dá)的基因和共同變化的生化途徑,如次生代謝物、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)、糖和多糖、氨基酸家族、激素等的合成或分解,可能分別為番茄對(duì)干旱的基本響應(yīng)基因和代謝調(diào)控方式。
　　 4.耐旱候選基因的分析。利用芯片結(jié)果,選取耐旱系與M82中有差異表達(dá)

8、的干旱響應(yīng)基因,為候選耐旱相關(guān)基因,克隆基因開放閱讀編碼框,對(duì)其編碼蛋白序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。
　　 5.候選基因的表達(dá)模式。通過(guò)半定量RT-PCR法,分析候選基因在番茄不同組織器官,以及在不同干旱脅迫程度和不同外界因子作用下的表達(dá)模式。結(jié)果表明,候選基因SlWRKY、SpWRKY、SINAC表達(dá)具有組織特異性,在成熟葉和莖中表達(dá)量都較高,而在果實(shí)和/或根中不表達(dá)。候選基因SlTR、SpTR和SpNAC則在根、莖、葉、花、果中

9、都表達(dá),但在果實(shí)和根中表達(dá)量仍比莖和葉中低。大部分候選基因在中度、重度脅迫下比輕度脅迫下表達(dá)變化明顯。在鹽、高低溫及.ABA較長(zhǎng)時(shí)間作用下,大部分候選基因都被誘導(dǎo)；而在SA作用下,除NAC基因外,其它基因都被誘導(dǎo)。
　　 6.候選基因的染色體定位分析。利用番茄基因組測(cè)序結(jié)果、擴(kuò)增片段多態(tài)性和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列法,對(duì)候選基因進(jìn)行染色體定位。SpTR基因定位于第11染色體11-D區(qū)；SpWRKY基因定位于第8染色體,包含于克隆代號(hào)為

10、C08SLe0011M12的BAC庫(kù)中；SpNAC基因定位于第10染色體10-D區(qū)域。
　　 7.候選基因的轉(zhuǎn)基因創(chuàng)建、表達(dá)分析及轉(zhuǎn)基因番茄的耐逆性鑒定。構(gòu)建候選基因超量表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將候選基因轉(zhuǎn)入番茄栽培種中蔬5號(hào)中。通過(guò)PCR法檢測(cè),獲得超量表達(dá)SpTR陽(yáng)性植株14棵,超量表達(dá)SpWRKY陽(yáng)性植株13棵,超量表達(dá)SpNAC陽(yáng)性植株19棵。利用半定量RT-PCR法,鑒定轉(zhuǎn)基因植株葉片中目的基因的表達(dá)量