Na-K-ATP酶α1亞基對偶聯(lián)蛋白Src功能的調(diào)控機制研究.pdf

1、ATP偶聯(lián)的膜轉(zhuǎn)運蛋白不僅具有轉(zhuǎn)運離子和代謝產(chǎn)物的功能，近年來已被證明同時具有傳遞細胞信號的功能，具有與G偶聯(lián)蛋白受體相似的功能和機制，是重要的藥物靶標群。本研究主要對一個重要的P型ATP偶聯(lián)膜轉(zhuǎn)運蛋白—Na/K-ATP酶的功能亞基α1如何調(diào)節(jié)偶聯(lián)Src蛋白介導的信號轉(zhuǎn)導功能進行了闡述，以便深入探討其作為藥物治療靶標的多重性。
　　 鈉鉀ATP酶（Na/K-ATPase），又稱鈉泵，其α1亞基(α1Na/K-ATPase)擁有離

2、子轉(zhuǎn)運和信號傳導的雙重功能。在上皮細胞中，α1Na/K-ATPase能和Src激酶形成受體復合物，此受體復合物在ouabain刺激下能激活Src激酶，并且體外實驗已經(jīng)證明這個Src的激活作用是跟α1Na/K-ATPase的構象轉(zhuǎn)化密切相關的。強心苷類藥物作用于Na/K-ATPase時同時影響了這兩個功能，這也是其毒副作用的來源。而到目前為止對Na/K-ATPase的一個研究瓶頸是我們無法將細胞內(nèi)Na/K-ATPase的離子轉(zhuǎn)運和信號傳導

3、功能分開。
　　 本論文利用基因點突變法構建了一個新的突變α1Na/K-ATPase，它仍保留了Na/K-ATPase的離子泵功能，但是喪失了對Src蛋白及其下游信號通路的調(diào)控作用。已報道在體外實驗中鑒定出α1Na/K-ATPaseN端的Naktide（S415到Q434）是和Src蛋白激酶結構域結合的部位，其中Naktide能結合并抑制Src活性。而本論文在此基礎上進一步研究了Naktide和Src結合的分子機制。首先通過體外

4、脯氨酸突變Naktide（脯氨酸替代丙氨酸能剖壞螺旋結構）和Src激酶活性實驗證明破壞Naktdie的螺旋結構后，Naktide不在有效抑制Src活性；再次，在細胞中表達A420P突變的α1Na/K-ATPase后，細胞內(nèi)Src活性顯著增加，配體ouabain不能再通過α1來激活Src蛋白，并且經(jīng)測定此突變不影響α1的離子轉(zhuǎn)運活性和構象轉(zhuǎn)化功能。
　　 本論文還創(chuàng)建了一對構象轉(zhuǎn)化缺陷的細胞株，進一步從細胞實驗證明了α1Na/K-

5、ATPase自身構象轉(zhuǎn)化對動態(tài)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Src活性的重要作用。已經(jīng)報道經(jīng)過純化的Na/K-ATPase體外實驗，證實α1對Src的調(diào)控是具有構象依賴性的，即在E1構象時，α1結合并抑制Src活性；而在ouabain結合的E2構象時，Src被激活。本論文則進一步從細胞水平研究這個α1蛋白構象轉(zhuǎn)化對結合Src并調(diào)控其信號轉(zhuǎn)導的作用。首先采用點突變法創(chuàng)建了I279A（細胞內(nèi)α1多數(shù)停滯在E1構象，叫做E1樣細胞）和F286A（細胞內(nèi)α1多數(shù)停

6、滯在E2構象，叫做E2樣細胞）這一對構象轉(zhuǎn)化缺陷的細胞系。跟體外實驗結果一致，在E1樣時，細胞內(nèi)Src活性被抑制，而在E2樣時，細胞內(nèi)Src活性顯著高于E1樣細胞。并且在這兩個細胞內(nèi)，ouabain都不能再激活Src，同時我們發(fā)現(xiàn)這個α1構象轉(zhuǎn)化缺陷對Src信號的影響是特異性的，因為它不改變ouabain引起的Akt信號變化。
　　 綜上所述，本論文首次創(chuàng)建了兩組細胞模型，一組是A-P突變α1，其中的典型模型A420P突變α1，

7、在細胞水平，它仍然有完好的離子泵功能，但是不能調(diào)控Src蛋白及其下游信號通路。這證實了Naktide的螺旋結構在結合并調(diào)控Src過程中的重要性。另一組模型是α1構象轉(zhuǎn)化缺陷型細胞。從細胞水平，我們認識到α1構象轉(zhuǎn)化的這種動態(tài)平衡對于α1調(diào)節(jié)Src活性及其下游信號通路具有重要意義。這些新的突變α1細胞模型可以作為篩選特異性的Na/K-ATPase/Src受體復合物的激動劑和拮抗劑的工具，來研發(fā)新型抗腫瘤，抗高血壓等心血管疾病藥物；同時我們