低氧脅迫對(duì)鰱線粒體ATP酶活性及β、γ、δ亞基表達(dá)的影響.pdf

1、線粒體ATP酶是機(jī)體生命活動(dòng)中供能的關(guān)鍵酶，它有F1和F0兩部分組成，在結(jié)合狀態(tài)下具有合成ATP的活性，而在分離狀態(tài)下具有水解ATP的活性，ATP的水解能夠驅(qū)動(dòng)F1的轉(zhuǎn)動(dòng)，跨膜的質(zhì)子流能促進(jìn)F0的轉(zhuǎn)動(dòng)，因此ATP酶通過(guò)F1和F0兩部分的有序配合，從而合成維持機(jī)體正常生命活動(dòng)所需的能量供給。
　　鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)，俗稱白鰱、跳鰱、水鰱、鰱子，隸屬于鯉形目（Cypriniformes），鯉科（

2、Cyprinidae），是我國(guó)著名的四大家魚之一，已成為我國(guó)主要養(yǎng)殖的淡水魚類之一。鰱由于性情活潑，喜跳躍，耐低氧能力較差，環(huán)境劇烈變化時(shí)易發(fā)生大水面積的浮頭泛塘現(xiàn)象，因而選育耐低氧鰱品種（系）已經(jīng)成為鰱新品種選育的重要研究課題之一。低氧狀態(tài)下，由于供氧不足，線粒體中的氧化磷酸化反應(yīng)受阻，不能及時(shí)有效的合成ATP，造成能量代謝受阻，無(wú)法滿足魚體對(duì)ATP正常的生理需求，魚類游動(dòng)緩慢，當(dāng)缺氧嚴(yán)重時(shí)，會(huì)導(dǎo)致魚類的死亡。
　　本文旨在通過(guò)

3、RACE技術(shù)對(duì)鰱線粒體ATP酶F1部分β、γ、δ亞基基因的克隆，采用SYBR-greenⅠ熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其在低氧脅迫過(guò)程中鰱各組織中的表達(dá)，及通過(guò)寡霉素抑制法對(duì)鰱線粒體ATP酶活性的變化情況等進(jìn)行分析，為進(jìn)一步闡明鰱低氧脅迫下線粒體ATP酶及F1各亞基的反應(yīng)機(jī)制提供一定的理論數(shù)據(jù)。本研究的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.低氧脅迫對(duì)鰱線粒體ATP酶活性的影響
　　隨著水體溶氧(DO)的逐漸降低，鰱心臟、腦、肝、脾和肌肉中線粒

4、體ATP酶活性均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，但不同組織中的變化情況不盡相同。當(dāng)DO為3.37mg/L時(shí)腦組織中線粒體ATP酶活性達(dá)到最高值，且顯著高于正常溶氧情況下的表達(dá)水平;心臟和肌肉組織在DO為2.11mg/L時(shí)ATP酶活性達(dá)到最高峰值，均顯著高于正常溶氧時(shí)的表達(dá)水平;當(dāng)鰱出現(xiàn)浮頭現(xiàn)象時(shí)(DO:1.12mg/L)其肝和脾臟組織中線粒體ATP酶活性出現(xiàn)最高峰值，顯著高于正常溶氧時(shí)的表達(dá)水平。
　　2.鰱線粒體ATP酶β基因cDNA的

5、克隆及表達(dá)
　　鰱線粒體ATP酶β基因cDNA序列全長(zhǎng)為1768bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為1557bp，編碼518個(gè)氨基酸。β是一個(gè)保守基因，其氨基酸序列與鯉魚的同源性達(dá)到了99％，與斑馬魚、青鱂、尼羅羅非魚、紅鰭東方鲀等分別為98％、98％、97％、97％。隨著DO的降低，鰱心臟、腦、肝、脾和肌肉組織中F1-β基因mRNA的表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)DO從正常溶氧降低到2.11mg/L過(guò)程中，β基因在心臟和腦中的表達(dá)量顯著升

6、高(P＜0.05)，之后隨著DO的繼續(xù)降低呈現(xiàn)急劇下降;肝、脾和肌肉中當(dāng)DO降低到3.37mg/L過(guò)程中β的表達(dá)顯著升高（P＜0.05），之后急劇下降(P＜0.05)。
　　3.鰱線粒體ATP酶γ基因cDNA的克隆及表達(dá)
　　鰱線粒體ATP酶γ基因cDNA序列全長(zhǎng)1154bp，ORF為879bp，編碼292個(gè)氨基酸。其氨基酸序列與斑馬魚的同源性達(dá)93％，其次與鯉、藍(lán)鯰魚、斑點(diǎn)叉尾鲴、大西洋鮭魚等分別達(dá)92％、92％、91％、

7、86％。隨著DO的降低，在腦、肝和肌肉中γ基因的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)DO為2.11mg/L時(shí)，腦和肝臟中γ基因表達(dá)量最高，顯著高于正常溶氧下的表達(dá)(P＜0.05），而在肌肉中，當(dāng)DO為3.37mg/L時(shí)γ表達(dá)量最高，且顯著高于正常水平(P＜0.05）;心臟中γ基因的表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)，顯著低于正常表達(dá)(P＜0.05);相反在脾中則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。
　　4.鰱線粒體ATP酶δ基因cDNA的克隆及表達(dá)
　　鰱線粒體

8、F1-δcDNA序列全長(zhǎng)為762bp，ORF為480bp，編碼159個(gè)氨基酸。其氨基酸序列與斑馬魚的同源性最高，達(dá)到了91％，與大西洋鮭、羅非魚、櫻花鉤吻鮭、紅鰭東方鲀等的同源性分別為84％、85％、84％、84％。隨著DO的逐漸降低，鰱F1-δmRNA的表達(dá)在心臟中呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，且與正常溶氧情況下的表達(dá)相比，有顯著差異(P＜0.05);在腦、肝、脾和肌肉中的表達(dá)先呈現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象，且與正常DO下的表達(dá)有顯著差異（P＜0.05），隨后

9、表達(dá)下調(diào)與正常DO組無(wú)顯著差異，其中在肝和脾組織中當(dāng)其表達(dá)量達(dá)到最高時(shí)，顯著(P＜0.05)高于正常DO組數(shù)十倍。
　　5.ATP酶活性與F1復(fù)合體中β、γ、δ亞基的關(guān)系
　　由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知鰱線粒體ATP酶F1復(fù)合體中β、γ、δ亞基均具有高度的保守性，ATP酶中具有催化作用的β亞基，隨著DO的逐漸降低，其表達(dá)變化與ATP的活性的活性的變化一致，β亞基的表達(dá)變化可反應(yīng)出ATP酶活性的變化。γ、δ亞基的表達(dá)均受到DO降低的影