dSTORM超分辨成像技術的實現(xiàn)及其應用.pdf

1、由于光的衍射作用，光學顯微成像技術一直受到瑞利判據(jù)的限制，其分辨率存在一定的極限:橫向分辨率約為200nm，軸向分辨率約為500nm。這種成像分辨率根本無法識別尺寸大多在幾納米到幾十納米之間的生物結(jié)構(gòu)，如蛋白質(zhì)等。目前已經(jīng)發(fā)展出多種能夠突破光學衍射極限的成像技術，稱為超分辨顯微成像技術(Super-Resolution ImagingMicroscopy)。常用的有受激發(fā)射光損耗成像技術、光激活定位顯微技術(Photoactivated

2、Localization Microscopy, PALM)、隨機光學重建技術(direct Stochastic OpticalReconstruction Microscopy, dSTORM)等。
　　本文首先在現(xiàn)有的實驗設備上搭建了基于單分子定位的超分辨成像平臺并實現(xiàn)了超分辨成像技術dSTORM;接著利用該技術實現(xiàn)了細胞肌動蛋白(actin)和微管蛋白(tublin)的超分辨成像。隨后，本論文還對dSTORM技術的實驗條件

3、及參數(shù)進行了優(yōu)化以獲得最佳成像條件來提高成像分辨率，最終分辨率可達24nm;最后，將優(yōu)化后的dSTORM技術應用于P小體(Processing Bodies)的超分辨成像。具體實驗內(nèi)容如下:
　　(1)超分辨單分子檢測平臺的建立。硬件部分:通過在配有TIRF光路的尼康倒置顯微鏡上配備各種成像設備如聲光可調(diào)諧濾波器來實現(xiàn)激發(fā)光的開關及光強控制、PFS系統(tǒng)米實現(xiàn)焦點漂移的校正、EMCCD實現(xiàn)熒光信號的采集等實現(xiàn)了檢測平臺的硬件平臺的搭

4、建;軟件部分:由于dSTORM是基于單分子定位檢測的成像技術，因此本文設計了基于單分子定位的成像算法，主要包括漂移校正、單分子的識別、超分辨圖像的重建算法等內(nèi)容。
　　(2) dSTORM成像技術的實現(xiàn)。采用光轉(zhuǎn)換有機合成染料Alexa Fluor647為探針來標記細胞的肌動蛋白及微管蛋白在搭建好的超分辨成像平臺上實現(xiàn)了微絲及微管的dSTORM成像，獲得了常規(guī)顯微方式無法得到的精細亞細胞結(jié)構(gòu)。
　　(3) dSTORM技術成

5、像條件及參數(shù)的優(yōu)化。通過分析dSTORM的原理及影響成像的各種因素，本論文實現(xiàn)了對其成像條件及參數(shù)的優(yōu)化，得到了最佳的實現(xiàn)條件。在該條件下，得到了更為清晰的細胞微絲結(jié)構(gòu)，成像分辨率能達到24nm左右。
　　(4)利用優(yōu)化后的dSTORM實現(xiàn)P小體（Dcp1a蛋白）的超分辨成像。采用免疫染色的方法（Alexa Fluor647作為探針）標記P小體的主要組成蛋白Dcp1a，利用優(yōu)化后的dSTORM技術得到了P小體在常規(guī)顯微方式下無法得