基于LFD-RPA的核酸可視化檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用.pdf

1、近年來，隨著人們對(duì)健康、環(huán)境的重視程度越來越高，與生命健康相密切相關(guān)各項(xiàng)的病原體檢測、產(chǎn)前診斷、遺傳病診斷、食品安全檢測變得越來越重要，核酸擴(kuò)增技術(shù)（Nucleic acid amplification technology,NAAT）可以從樣品中檢測出痕量目標(biāo)分子，具有靈敏特異等諸多優(yōu)勢，已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的一個(gè)基本和必要的技術(shù)手段，并在各個(gè)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，但是傳統(tǒng)的擴(kuò)增技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室、儀器及人員要求較高，快速、便攜、可應(yīng)用于床旁、現(xiàn)

2、場檢測（point-of-care testing,POCT）的NAAT相對(duì)缺乏。近年來恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了NAAT技術(shù)在POCT中的應(yīng)用，它不需要高溫變性、退火等步驟，對(duì)精密儀器依賴程度大大降低，是實(shí)現(xiàn)POCT有效的技術(shù)手段。其中，重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）相較于其它恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)更具有優(yōu)勢，它對(duì)樣本要求低，可在25-45℃下15分鐘內(nèi)將痕

3、量核酸模板擴(kuò)增到可檢測水平，與側(cè)流層析試紙條（lateral flow dipstick，LFD）結(jié)合應(yīng)用形成的LFD-RPA體系能實(shí)現(xiàn)肉眼直接判定結(jié)果，非常適合資源匱乏地區(qū)和野外應(yīng)用。
　　目前，關(guān)于RPA技術(shù)的相關(guān)研究工作已多有報(bào)道，例如手足口病毒、結(jié)核分支桿菌、登革熱病毒、惡性瘧原蟲等病原體。以上這些工作都極大的推動(dòng)了分子診斷技術(shù)在POCT領(lǐng)域中的應(yīng)用。但是，這些工作還存在的一個(gè)很大的缺陷就是，他們?cè)趶臉悠窚?zhǔn)備到結(jié)果判定的整

4、個(gè)工作中，往往只針對(duì)其中的某個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn)，而沒有形成完整的診斷系統(tǒng)，尤其沒有完全脫離對(duì)電的依賴，限制了其在野外及現(xiàn)場檢測中的廣泛應(yīng)用。此外，非封閉操作方式所形成的氣溶膠污染也是限制其應(yīng)用的瓶頸問題。
　　本課題的目標(biāo)是，構(gòu)建一種集核酸提取、擴(kuò)增和結(jié)果判定功能的完整的檢測系統(tǒng)，不僅能達(dá)到簡捷、靈敏、特異的檢測目的，而且全程不依賴電力，也無核酸氣溶膠污染的產(chǎn)生，以更好地為野外及現(xiàn)場檢測等POCT應(yīng)用服務(wù)。本研究中，本課題組通過文獻(xiàn)

5、調(diào)研與預(yù)實(shí)驗(yàn)，探索構(gòu)建最佳LFD-RPA反應(yīng)體系的方法。同時(shí)，設(shè)計(jì)了一個(gè)快速、簡易、無需加熱和離心操作的堿裂解-紙基快速核酸提取裝置（Alkaline lysis combined with paper-based filtration isolation of nucleic acid,ALP FINA）和一個(gè)能克服LFD-RPA氣溶膠污染問題的密閉可視化重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增檢測裝置（Sealed and visual recombi

6、nase polymerase amplification test,SV RPA），將他們組合應(yīng)用后形成一個(gè)具備核酸提取、擴(kuò)增和結(jié)果判定功能的集成化的檢測體系。此檢測體系可以實(shí)現(xiàn)常溫下反應(yīng)，30-40分鐘完成整個(gè)檢測。尤為重要的是，它可以在無電力的環(huán)境下應(yīng)用，非常適用于基層衛(wèi)生部門，尤其是在野外及現(xiàn)場檢測中具有極大優(yōu)勢。
　　本研究將這個(gè)能夠?qū)崿F(xiàn)從樣本準(zhǔn)備到可視化檢測的完整的檢測體系，應(yīng)用于日本血吸蟲和腺病毒檢測，分別針對(duì)這兩種

7、病原體建立快速、靈敏、特異、可視化的LFD-RPA檢測技術(shù)，評(píng)價(jià)其靈敏度與特異性，驗(yàn)證最佳反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間，并利用一定數(shù)量的臨床樣本，對(duì)檢測體系進(jìn)行效果評(píng)估。
　　具體研究結(jié)果如下：
　　一、簡易核酸提取方法的建立
　　本研究中建立了堿裂解法結(jié)合紙基核酸純化的ALP FINA樣本處理體系，該體系包括過濾器和核酸提取膜，可用于不同類型樣本。它利用強(qiáng)堿使細(xì)胞膜及核膜迅速破裂，促進(jìn)核蛋白、核酸酶變性及DNA釋放，然后通過f

8、usion5膜進(jìn)行純化。通過與之匹配應(yīng)用的便攜式核酸提取器，可以使整個(gè)操作更加便捷、高效，只需向核酸提取器加樣口，順序加入標(biāo)本與NaOH混合液、無水乙醇及雙蒸水，中途無需過柱、離心、加熱等煩瑣步驟，也無需特殊的儀器設(shè)備及電力支持，整個(gè)過程只需10-15分鐘，且可用于不同類型樣本，非常適合現(xiàn)場核酸提取，可直接用于分子診斷和檢測實(shí)驗(yàn)。
　　二、LFD-RPA最佳檢測體系建立方法
　　建立LFD-RP最佳體系的關(guān)鍵是引物及探針的設(shè)

9、計(jì)。RPA引物設(shè)計(jì)原則為：引物長度30-35 bp；避免5’端長的G序列，否則會(huì)影響重組酶與引物結(jié)合；推薦3’端用G、C序列；自由能應(yīng)低于4 Kcal/mol；在30℃以下不會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。LFD-RPA探針設(shè)計(jì)原則：長46-52 bp；在距5’端最短30 bp，距3’端最遠(yuǎn)15 bp處堿基由四氫呋喃（THF）替代；5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)。
　　三、基于LFD-RPA技術(shù)的日本血吸蟲檢測方法的建立與評(píng)價(jià)
　　針對(duì)日本血吸蟲

10、基因組重復(fù)序列SjR2設(shè)計(jì)并選取最佳引物，然后根據(jù)引物設(shè)計(jì)探針，建立 LFD-RPA檢測體系。經(jīng)驗(yàn)證，其靈敏度高，可達(dá)到5fg/μl，與qPCR結(jié)果一致；其特異性好，不會(huì)與其它人體寄生蟲發(fā)生交叉反應(yīng)；且溫度要求低，反應(yīng)速度快，可以在25-45℃的溫度范圍內(nèi)15-20分鐘完成。當(dāng)分別應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)（ELSIA）、間接免疫技術(shù)（IHA）及LFD-RPA技術(shù)，對(duì)14例經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)法（改良加藤法：Kato-Katz）檢測陽性患者及31例北京地

11、區(qū)健康志愿者糞便樣本DNA進(jìn)行檢測，LFD-RPA檢測靈敏度為92.68％，特異性達(dá)100%，與金標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行Kappa一致性比對(duì)時(shí)結(jié)果為極好（κ=0.947,Z=6.36,P<0.001），而ELSIA靈敏度85.71%，特異性93.55，kappa結(jié)果為較好（κ=0.793,Z=5.31,P<0.001），IHA靈敏度78.57%，特異性83.87%，kappa結(jié)果為一般(κ=0.600,Z=4.05,P<0.001)。以上結(jié)果證明，

12、基于LFD-RPA技術(shù)的日本血吸蟲檢測體系，遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測技術(shù)。
　　四、基于LFD-RPA技術(shù)的B、E型腺病毒檢測方法的建立與評(píng)價(jià)
　　以B、E型腺病毒殼蛋白保守序列為檢測靶序列，建立基于LFD-RPA技術(shù)的檢測方法，此LFD-RPA檢測體系可同時(shí)檢出Adv-B及Adv-E且特異性極佳，不會(huì)與其它型別腺病毒及其它病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。它的檢測靈敏度高，對(duì)AdvB及AdvE的檢測下限均為10 copies/μl，雖然略低于qP

13、CR（AdvB：5 copies/μl，AdvE：5 copies/μl），但已極為接近足以滿足臨床需要，且其簡便性及快速性遠(yuǎn)優(yōu)于qPCR。該檢測體系在20℃到45℃的溫度范圍內(nèi)均可以有效進(jìn)行，這樣的溫度范圍意味著該檢測體系可以擺脫對(duì)加熱設(shè)備的依賴。另外，通過對(duì)RPA的反應(yīng)時(shí)間分析，確定了它可以在10-15分鐘內(nèi)將靶核酸擴(kuò)增到可檢測水平，遠(yuǎn)快于PCR及免疫學(xué)等方法。當(dāng)對(duì)20例陽性和10例陰性臨床樣本進(jìn)行檢測時(shí)，其靈敏度和特異性均達(dá)100

14、%。
　　五、密閉LFD-RPA反應(yīng)裝置的研發(fā)
　　本研究中研發(fā)了一種便攜、封閉的SV RPA核酸可視化檢測裝置，將整個(gè)LFD-RPA反應(yīng)體系整合于此裝置內(nèi)，可使RPA擴(kuò)增、反應(yīng)介質(zhì)遞送和LFD檢測全過程在同一密閉空間完成，無需開蓋，可有效地避免核酸氣溶膠污染產(chǎn)生。
　　六、核酸檢測完整體系的形成
　　我們將快速簡易的核酸提取裝置ALP FINA與密閉可視化的SVRPA核酸檢測裝置組合形成了一個(gè)集核酸提取、擴(kuò)增和