基于表面等離子體共振技術(shù)的包膜病毒進(jìn)入抑制劑-生物膜相互作用機(jī)制研究.pdf

1、包膜病毒的進(jìn)入抑制劑主要包括抗體類進(jìn)入抑制劑和多肽類融合抑制劑，通常通過作用于病毒包膜糖蛋白阻斷其進(jìn)入細(xì)胞過程的不同階段，從而達(dá)到抑制病毒的目的。人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（Type-1 human immunodeficiency virus，HIV-1）融合抑制劑是目前研究最為廣泛深入的包膜病毒進(jìn)入抑制劑之一，而2013年底西非埃博拉疫情影響廣泛，使得埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）進(jìn)入抑制劑成為近年來包膜病毒進(jìn)入抑制劑研究

2、的熱點(diǎn)。HIV-1在感染過程中通過表面糖蛋白gp120亞基與靶細(xì)胞受體結(jié)合，然后gp41亞基經(jīng)過一系列結(jié)構(gòu)變化介導(dǎo)HIV-1與靶細(xì)胞融合。EBOV的進(jìn)入機(jī)制與HIV-1略有不同，首先通過表面糖蛋白GP1亞基與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合使病毒內(nèi)化，之后GP2亞基通過與HIV-1的gp41亞基類似的過程介導(dǎo)EBOV與靶細(xì)胞膜融合。目前對(duì)于包膜病毒進(jìn)入抑制劑的作用機(jī)制的研究大部分著眼于進(jìn)入抑制劑與病毒包膜糖蛋白的相互作用，然而進(jìn)入抑制劑與生物膜的相互

3、作用方式對(duì)其藥效同樣至關(guān)重要。本課題選擇多肽類HIV-1融合抑制劑，中和抗體類EBOV進(jìn)入抑制劑和由EBOV的GP2亞基C肽序列衍生而來的融合抑制多肽作為研究對(duì)象，通過研究它們與生物膜的相互作用特點(diǎn)，在生物膜水平上闡明它們的精確作用機(jī)制，并進(jìn)一步探討該作用機(jī)制與藥效的關(guān)系。
　　過去進(jìn)行生物膜機(jī)理研究的方法通常為一些物理-化學(xué)方法，如熒光光譜或電化學(xué)分析等，然而這些方法存在一些缺點(diǎn)。本課題中我們使用基于表面等離子體共振（Surfa

4、ce plasmon resonance，SPR）技術(shù)的Biacore生物傳感器研究包膜病毒進(jìn)入抑制劑與生物膜的相互作用。SPR技術(shù)可以連續(xù)監(jiān)測(cè)結(jié)合動(dòng)力學(xué)過程，具有極高的靈敏度，樣品不需要經(jīng)過熒光標(biāo)記，具有其它傳統(tǒng)方法不具備的優(yōu)點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道病毒包膜中飽和磷脂(DPPC)、膽固醇、鞘磷脂(SM)等剛性成分的含量明顯高于宿主細(xì)胞膜，因此我們選用不飽和磷脂POPC模擬普通宿主細(xì)胞膜，選用DPPC、膽固醇和SM等剛性成分模擬病毒包膜，選用帶正

5、電荷的EPC和帶負(fù)電荷的POPG考察靜電作用力對(duì)包膜病毒進(jìn)入抑制劑與生物膜相互作用的影響。在Biacore T200生物大分子相互作用儀的傳感芯片HPA和L1上分別構(gòu)建單層和雙層生物膜模型，成功構(gòu)建了基于SPR技術(shù)的包膜蛋白進(jìn)入抑制劑－生物膜相互作用系統(tǒng)，克服了常規(guī)方法的局限性。
　　在第一章中，我們分別研究了最具代表性的多肽類HIV-1融合抑制劑西夫韋肽、恩夫韋肽和T1249與生物膜的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：西夫韋肽選擇性結(jié)合D

6、PPC（親和力比POPC雙層膜高32倍）和SM（親和力比POPC雙層膜高31倍）；T1249選擇性結(jié)合富含DPPC的生物膜（親和力比POPC雙層膜高9.6倍）和SM（親和力比POPC高7.7倍）；而恩夫韋肽不能選擇性結(jié)合富含剛性成分的生物膜。另外，參與研究的三種多肽類融合抑制劑與生物膜的相互作用均為表面結(jié)合，不存在插入或成孔。三種多肽對(duì)EPC生物膜的親和力并不比中性離子磷脂成分的生物膜高，說明在多肽與生物膜的相互作用中起主要作用的是疏水

7、作用力而不是靜電作用力。西夫韋肽和T1249比恩夫韋肽的抗病毒藥效和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)更好，可能是由于它們選擇性結(jié)合類似病毒膜和宿主細(xì)胞膜脂筏區(qū)域成分的生物膜，而作為融合過程關(guān)鍵因素的糖蛋白和相關(guān)受體就分別位于病毒包膜和脂筏區(qū)域，因此我們推測(cè)富含剛性成分的生物膜作為催化劑先將抑制劑催化到膜表面，然后抑制劑再與膜表面蛋白作用，產(chǎn)生抑制效果。我們將這種富含剛性成分的膜定義為“融合抑制催化膜”，這種“融合抑制催化膜”有可能成為HIV-1融合抑制劑

8、的新靶標(biāo)。
　　EBOV具有與HIV-1類似的進(jìn)入機(jī)制。針對(duì)2013年底在西非爆發(fā)的埃博拉疫情，目前還沒有獲批上市的特效藥物。在第二章中我們研究了中和抗體類EBOV進(jìn)入抑制劑和由EBOV C肽衍生而來的融合抑制多肽。首先研究了由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院牽頭研發(fā)的極具開發(fā)潛力的中和抗體類EBOV進(jìn)入抑制劑MIL77與生物膜的相互作用。MIL77由三種人鼠嵌合單抗MIL77-1，MIL77-2和MIL77-3組成。研究結(jié)果顯示：MIL77-1能

9、夠選擇性結(jié)合DPPC（親和力比POPC大2.9倍）、富含膽固醇的生物膜（親和力比POPC大2倍）和POPG（親和力比POPC大5.6倍）。MIL77-1的作用靶點(diǎn)是與融合功能直接相關(guān)的GP2亞基，而其對(duì)生物膜剛性成分的選擇性使其能夠靶向 GP2亞基所在的病毒包膜和相關(guān)受體所在的宿主細(xì)胞膜脂筏區(qū)域，對(duì)POPG的選擇性使其能夠通過靜電作用力固定在生物膜上，從而使MIL77-1能夠在融合位點(diǎn)富集，有利于發(fā)揮其抗病毒作用。MIL77-2和MIL

10、77-3對(duì)細(xì)胞膜的剛性成分沒有選擇性。MIL77-2的作用靶點(diǎn)是GP1亞基，該亞基與病毒融合過程不直接相關(guān)；MIL77-3的作用靶點(diǎn)是分泌型糖蛋白 sGP，并不位于病毒包膜上，因此MIL77-2和MIL77-3的生物學(xué)功能可能不依賴對(duì)生物膜成分的選擇性。MIL77的研發(fā)者最近發(fā)表的最新研究進(jìn)展顯示，新的抗體組合MIL77E僅需兩種抗體蛋白MIL77-1和MIL77-3即可完全保護(hù)致死劑量感染的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，提示MIL77-2對(duì)于MIL

11、77發(fā)揮抗病毒效果并不是必需的。這一結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了MIL77和MIL77E的抗病毒療效與其對(duì)生物膜成分的選擇性密切相關(guān)，富含剛性成分的生物膜可以在融合抑制過程之前作為催化劑促進(jìn)藥物在作用位點(diǎn)富集，從而提高藥物的療效。
　　研究者參照HIV融合抑制劑的設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)合成了由EBOV的C肽序列衍生而來的融合抑制多肽Ebo-only。研究結(jié)果顯示，Ebo-only對(duì)細(xì)胞膜的剛性成分沒有選擇性。體外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ebo-only序列的抗E

12、BOV活性非常弱，其原因可能是多肽Ebo-only很難穿過宿主細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，也就無法直接結(jié)合到融合位點(diǎn)發(fā)揮其抑制融合的作用。研究者發(fā)現(xiàn)在Ebo-only的N端鏈接具有內(nèi)化功能的Tat序列形成Tat-Ebo和鏈接膽固醇形成Chol-Ebo都可以大大增強(qiáng)多肽的抗EBOV活性。
　　通過研究Tat-Ebo與生物膜的相互作用發(fā)現(xiàn)，Tat-Ebo能夠選擇性結(jié)合富含剛性成分的單層生物膜模型。同時(shí)，Tat-Ebo與生物膜模型的結(jié)合量比Ebo

13、-only大10-40倍。由于Tat序列帶有強(qiáng)烈的正電荷，因此Tat-Ebo通過靜電作用力與帶負(fù)電荷的POPG雙層生物膜結(jié)合的最高響應(yīng)值Rmax超過20000 RU，是其它生物膜的數(shù)倍，說明Tat-Ebo與雙層生物膜的大量結(jié)合主要是由靜電作用力驅(qū)動(dòng)的。Tat-Ebo可能的作用機(jī)制是首先通過以靜電相互作用力為主的相互作用大量結(jié)合在生物膜表面，繼而通過胞吞過程進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮其C肽序列對(duì)于“融合抑制劑催化膜”選擇性結(jié)合特點(diǎn)，在融合位點(diǎn)附近富

14、集，增加了藥物作用位點(diǎn)附近的藥物濃度，進(jìn)而與膜表面蛋白相互作用發(fā)揮融合抑制劑功能，從而增強(qiáng)了藥效，改善了藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
　　研究Chol-Ebo與生物膜的相互作用發(fā)現(xiàn)，Chol-Ebo對(duì)細(xì)胞膜的剛性成分沒有選擇性。Chol-Ebo對(duì)雙層生物膜模型的結(jié)合量比Tat-Ebo高一倍，且不易解離，可能是造成Chol-Ebo比Tat-Ebo抗病毒活性更高的一個(gè)原因。Chol-Ebo對(duì)POPG雙層生物膜模型的結(jié)合量小于Tat-Ebo，說明靜

15、電作用力不是Chol-Ebo與生物膜的主要相互作用力。Chol-Ebo可能的作用機(jī)制是首先通過疏水作用力和靜電相互作用力大量結(jié)合在生物膜表面，繼而通過胞吞過程進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與膜表面蛋白相互作用發(fā)揮融合抑制劑功能，增強(qiáng)了藥效。對(duì)于在細(xì)胞內(nèi)完成融合過程的EBOV，其融合抑制多肽穿膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的能力可能是其發(fā)揮融合抑制作用的關(guān)鍵。
　　本研究應(yīng)用基于SPR技術(shù)的包膜蛋白進(jìn)入抑制劑-生物膜相互作用研究系統(tǒng)，全面研究了包膜病毒多肽/蛋白類進(jìn)