無(wú)尾兩棲類MHC Ⅰ類基因的多態(tài)性及其進(jìn)化機(jī)制.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)是存在于脊椎動(dòng)物中的一類具有極高多態(tài)性的基因家族。MHC基因編碼的細(xì)胞表面糖蛋白能將內(nèi)源或外源性抗原呈遞到T淋巴細(xì)胞，因此MHC基因在脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中具有非常重要的作用?，F(xiàn)有的研究表明，MHC基因的多態(tài)性與抵御病原的能力存在相關(guān)性，是長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，因此研究其進(jìn)化能揭示MHC基因多態(tài)性的形成機(jī)制，有助于我們了解免疫相關(guān)蛋白的進(jìn)化?，F(xiàn)有對(duì)M

2、HC基因的多態(tài)性及進(jìn)化機(jī)制的研究主要集中在哺乳類、魚(yú)類、鳥(niǎo)類等動(dòng)物中，而對(duì)兩棲類MHC基因多態(tài)性及其進(jìn)化機(jī)制尚不清楚。兩棲類在MHC基因進(jìn)化中具有關(guān)鍵的地位，作為最早登陸的四足動(dòng)物，其水陸兩棲的生活習(xí)性使其可能面臨更復(fù)雜的微生物環(huán)境。為更加系統(tǒng)、深入的了解兩棲類MHCⅠ類基因的多態(tài)性及其進(jìn)化機(jī)制，本研究選擇了兩棲無(wú)尾類5個(gè)科（角蟾科、鈴蟾科、蟾蜍科、蛙科、樹(shù)蛙科）的9個(gè)物種——桑植角蟾（Megophrys sangzhiensis）、峨

3、眉髭蟾（Vibrissaphora boringii）、雷山髭蟾（Vibrissaphora leishanensis）、東方鈴蟾（Bombina orientalis）、中華蟾蜍（Bufo gargarizans）、澤陸蛙（Fejervaryalimnocharis）、黑斑側(cè)褶蛙（Pelophylax nigromaculata）、大樹(shù)蛙（Rhacophorusdennysi）和經(jīng)甫樹(shù)蛙（Rhscophorus Chenfui）為研究

4、對(duì)象，利用分子克隆和DNA測(cè)序的方法獲得MHCⅠ類基因的外顯子2-4的序列，分析其多態(tài)性，并解釋其進(jìn)化的分子機(jī)制。
　　本研究利用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)得到雷山髭蟾、桑植角蟾和大樹(shù)蛙等物種MHCⅠ類基因的部分序列開(kāi)發(fā)了兩對(duì)引物，成功的克隆測(cè)序得到9個(gè)代表物種的MHCⅠ類基因的序列1800條序列，長(zhǎng)度在730 bp左右，包含了完整的外顯子3和部分外顯子2和4。我們從9個(gè)代表物種90個(gè)個(gè)體的1800條序列中鑒定得到78個(gè)MHCⅠ類基因

5、的等位基因，其中經(jīng)甫樹(shù)蛙12個(gè)、大樹(shù)蛙9個(gè)、黑斑側(cè)褶蛙6個(gè)、澤陸蛙11個(gè)、中華蟾蜍8個(gè)、雷山髭蟾10個(gè)、峨眉髭蟾9個(gè)、桑植角蟾5個(gè)、東方鈴蟾8個(gè)。9個(gè)代表物種的不同個(gè)體檢測(cè)得到的等位基因存在差別，單個(gè)個(gè)體最多檢測(cè)得到4個(gè)等位基因，推測(cè)東方鈴蟾、雷山髭蟾、經(jīng)甫樹(shù)蛙、澤陸蛙和中華蟾蜍至少含有兩個(gè)MHCⅠ類基因座位，桑植角蟾、峨眉髭蟾、大樹(shù)蛙和黑斑側(cè)褶蛙至少含有一個(gè)MHCⅠ類基因座位。9個(gè)代表物種含有多基因座的現(xiàn)象說(shuō)明兩棲類MHCⅠ類基因在進(jìn)

6、化過(guò)程中曾發(fā)生過(guò)基因復(fù)制，符合脊椎動(dòng)物MHC基因“出生-死亡”(Birth-and-death model)的進(jìn)化假說(shuō)。
　　9個(gè)代表物種的78個(gè)等位基因在氨基酸和核苷酸水平均呈現(xiàn)了高度的多態(tài)性，其中外顯子2和3的多態(tài)性明顯高于外顯子4的多態(tài)性，最高的是外顯子2，外顯子4的氨基酸序列相對(duì)于外顯子2和3最為保守。預(yù)示著除了基因復(fù)制外，平衡選擇和基因重組在兩棲類MHCⅠ類基因多態(tài)性的進(jìn)化過(guò)程中起著非常重要的作用。
　　我們通過(guò)比

7、較不同外顯子的非同義突變率及同義突變率比值（dⅣ/ds）以及5種基于密碼子的模型（SLAC,REL，F(xiàn)EL，MEME，Codeml）對(duì)9個(gè)代表物種78個(gè)等位基因的序列進(jìn)行了選擇作用的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)9個(gè)物種MHCⅠ類基因的氨基酸距離大于核苷酸距離，暗示著這些基因受到了選擇作用。而且，9個(gè)物種的MHCⅠ類基因的的大部分區(qū)域的非同義突變率及同義突變率比值是大于1，特別是抗原呈遞區(qū)域，這說(shuō)明MHCⅠ類基因在進(jìn)化過(guò)程中受到了正選擇的作用。通過(guò)5種模型

8、檢測(cè)到52個(gè)受到正選擇的氨基酸位點(diǎn)，這些位點(diǎn)多位于外顯子2和3區(qū)域，包括了10個(gè)推斷的抗原呈遞位點(diǎn)，這說(shuō)明MHCⅠ類基因特別是抗原呈遞區(qū)域經(jīng)歷了較強(qiáng)烈的平衡選擇。通過(guò)建立兩棲類的MHCⅠ類基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)蛙科與樹(shù)蛙科的物種以及角蟾科內(nèi)的物種存在跨物種多態(tài)性，進(jìn)一步說(shuō)明了兩棲類MHCⅠ類基因在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了平衡選擇。
　　同時(shí)，在這9個(gè)代表物種的MHCⅠ類等位基因中檢測(cè)到了多個(gè)重組現(xiàn)象的發(fā)生，78個(gè)等位基因中有37個(gè)等位基因

9、通過(guò)基因重組產(chǎn)生，重組位點(diǎn)多位于外顯子2及外顯子3和外顯子3及外顯子4交界處附近，類似于硬骨魚(yú)MHCⅠ類基因的重組模式。這個(gè)結(jié)果表明基因重組也是兩棲類MHCⅠ類基因進(jìn)化的重要分子機(jī)制之一。
　　另外，我們通過(guò)建立MHCⅠ類等位基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)比較不同物種的MHCⅠ類基因的發(fā)生關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與其他脊椎動(dòng)物相比，兩棲類MHCⅠ類基因的譜系比較古老。
　　總之，我們的結(jié)果表明兩棲類MHCⅠ類基因具有豐富的多態(tài)性，基因復(fù)制、平衡選擇和