體外研究GPR30-PI3K-Akt信號通路在三陰性乳腺癌轉移中發(fā)揮作用的機制.pdf

1、目的：三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）為雌激素受體、孕激素受體及Her-2受體均表達陰性的乳腺癌類型，也是難治性乳腺癌中的代表類型。這類患者具有發(fā)病年齡輕，復發(fā)轉移率高、內分泌治療基本無效、生存期短等臨床特點，并一度是國內外學者研究的重點。近年有研究者發(fā)現(xiàn)，在部分雌激素受體陰性的乳腺癌組織中，非經典的雌激素受體G蛋白偶聯(lián)雌激素受體30（G protein-coupled recepte

2、r, GPR30）呈現(xiàn)較高的陽性表達，雌激素有可能通過與GPR30的結合繼續(xù)發(fā)揮促進乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。因此，GPR30有可能成為三陰性乳腺癌新的治療靶點。而GPR30的作用機制與經典雌激素受體不同，它可反式激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）及其下游信號通路發(fā)揮快速的非基因型雌激素效應。另有研究提示，EGFR高表達的乳腺癌患者預示預后不良，并對指導乳腺癌臨床治療具有一定

3、臨床意義。進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，GPR30可間接通過激活EGFR-MAPK/Erk通路促進腫瘤細胞的增殖。那么，GPR30與EGFR下游其他信號通路之間是否也有相互作用并對三陰性乳腺癌轉移行為產生影響呢。
　　磷脂酰基醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）是EGFR下游信號通路中重要的信號分子，PI3K/Akt信號通路在多種惡性腫瘤中都有異常激活及過表達現(xiàn)象，提示此條信號通路可能在腫瘤轉移進程

4、中也發(fā)揮著重要作用。本研究旨在探討在高表達GPR30的三陰性乳腺癌細胞中， GPR30與PI3K/Akt信號通路之間是否存在相互影響，并協(xié)同影響乳腺癌轉移。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)在含5％CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)乳腺癌細胞系。
　　2.采用Western-blot的實驗方法檢測4種不同病理類型的乳腺癌細胞系中GPR30蛋白表達情況。
　　3.采用免疫熒光染色實

5、驗方法檢測GPR30在三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-468中的定位。
　　4.采用Western-blot實驗方法檢測隨著雌二醇（E2)及GPR30特異性激動劑（G1）的刺激濃度梯度及時間梯度的增加，MDA-MB-468細胞p-PI3K的蛋白表達水平。
　　5.采用Western-blot的方法檢測使用GPR30特異性阻斷劑（G15）阻斷E2和G1對GPR30的活化效應后，MDA-MB-468細胞內p-PI3K的蛋白表達水平

6、。
　　6.采用劃痕實驗檢測GPR30-PI3K/Akt信號通路對腫瘤遷移能力的影響。
　　7.統(tǒng)計學方法：采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據處理，計量資料采用x±s表示,組間比較采用單因素方差分析，采用LSD法進行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：14種乳腺癌細胞MDA-MB-468、MCF-7、MDA-MA-231及MDA-MB-453， Western blot法檢測 GPR30的蛋白

7、表達量分別為0.74±0.065、0.92±0.06、0.22±0.04、0.59±0.045；從結果可看出，三陰性MDA-MB-468細胞及ER陽性的MCF-7中GPR30高表達，而另一種三陰性乳腺癌細胞MDA-MA-231則幾乎不表達（P<0.05）。2由免疫熒光染色實驗結果得出，GPR30主要位于細胞的胞質中。3 E2濃度梯度為0ng5ng10ng20ng，刺激MDA-MB-468細胞后p-PI3K蛋白表達水平分別為：0.98±0

8、.06、1.18±0.061、1.40±0.086、1.5±0.025；E2時間梯度為0min、5min、10min、20min，p-PI3K蛋白表達水平分別為：0.96±0.042、1.17±0.04、1.49±0.031、0.74±0.056； G1濃度梯度為0nM1nM10nM100nM，刺激MDA-MB-468細胞后p-PI3K蛋白表達水平分別為：0.96±0.08、1.17±0.042、1.33±0.036、1.47±0.05

9、9；G1時間梯度為0min、5min、10min、20min，p-PI3K蛋白表達水平分別為：0.92±0.035、1.18±0.026、1.44±0.122、0.75±0.049。統(tǒng)計分析得出，隨著GPR30激動劑濃度及時間的增加，p-PI3K蛋白表達水平也逐漸增加，并具有濃度及時間依賴性（P<0.05）；此實驗結果提示：激動劑活化GPR30后，很可能反式激活了EGFR下游PI3K/Akt信號通路，使p-PI3K蛋白表達增加，進而參與

10、促進腫瘤進展。4通過Western blot法檢測Control、E2處理組、G1處理組、E2+G15處理組、G1+G15處理組各組p-PI3K蛋白半定量水平分別為：0.95±0.04、1.43±0.05、1.42±0.03、0.58±0.06、0.62±0.10；實驗結果示，E2及G1處理組p-PI3K蛋白表達顯著升高，而加入GPR30特異性阻斷劑G15的處理組p-PI3K蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），此實驗結果進一步說明了G

11、PR30與PI3K/Akt信號通路之間可能存在某種相互關系。5劃痕實驗測分組為control、E2處理組、G1處理組、E2+G15處理組、 E2+LY294002處理組、G1+G15處理組、G1+LY294002處理組，各組細胞遷移距離分別為（55.33±11.37）μm、(263.67±19.76)μm、(272.33±9.29)μm、(51.67±3.51)μm、(49.33±4.04)μm、(55.67±4.04)μm、(56.3

12、3±8.50)μm；由此實驗結果可看出， E2及G1處理組與對照組相比細胞遷移能力顯著增強（P<0.05），而不論是使用GPR30特異性阻斷劑阻斷GPR30的活化效應還是使用PI3K抑制劑阻斷磷酸化PI3K的作用，都可明顯減弱細胞遷移能力（P<0.05）；此結果提示，GPR30-PI3K/Akt信號通路的活化可影響乳腺癌細胞的遷移能力。
　　結論：
　　1.隨著激動劑E2和G1刺激濃度梯度及時間梯度的升高，P-PI3K蛋白表

13、達水平也逐漸升高，提示GPR30與PI3K/Akt信號通路之間確實可能存在某種相互關系。
　　2.E2及G1活化GPR30后，可反式激活PI3K/Akt信號通路，促進腫瘤細胞遷移能力；但通過抑制劑抑制GPR30或者PI3K的活化效應，阻斷這一信號通路后，腫瘤細胞遷移能力則明顯減弱。
　　3.綜合以上實驗結果我們初步證實，GPR30與PI3K/Akt信號通路之間可能通過某種方式存在交叉關系，并進一步對乳腺癌細胞轉移產生重要影響