體外研究GPR30-PI3K-Akt信號(hào)通路在三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用的機(jī)制.pdf

1、目的：三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）為雌激素受體、孕激素受體及Her-2受體均表達(dá)陰性的乳腺癌類型，也是難治性乳腺癌中的代表類型。這類患者具有發(fā)病年齡輕，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、內(nèi)分泌治療基本無(wú)效、生存期短等臨床特點(diǎn)，并一度是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。近年有研究者發(fā)現(xiàn)，在部分雌激素受體陰性的乳腺癌組織中，非經(jīng)典的雌激素受體G蛋白偶聯(lián)雌激素受體30（G protein-coupled recepte

2、r, GPR30）呈現(xiàn)較高的陽(yáng)性表達(dá)，雌激素有可能通過(guò)與GPR30的結(jié)合繼續(xù)發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。因此，GPR30有可能成為三陰性乳腺癌新的治療靶點(diǎn)。而GPR30的作用機(jī)制與經(jīng)典雌激素受體不同，它可反式激活表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）及其下游信號(hào)通路發(fā)揮快速的非基因型雌激素效應(yīng)。另有研究提示，EGFR高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)示預(yù)后不良，并對(duì)指導(dǎo)乳腺癌臨床治療具有一定

3、臨床意義。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，GPR30可間接通過(guò)激活EGFR-MAPK/Erk通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。那么，GPR30與EGFR下游其他信號(hào)通路之間是否也有相互作用并對(duì)三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移行為產(chǎn)生影響呢。
　　磷脂?；?激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）是EGFR下游信號(hào)通路中重要的信號(hào)分子，PI3K/Akt信號(hào)通路在多種惡性腫瘤中都有異常激活及過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，提示此條信號(hào)通路可能在腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程

4、中也發(fā)揮著重要作用。本研究旨在探討在高表達(dá)GPR30的三陰性乳腺癌細(xì)胞中， GPR30與PI3K/Akt信號(hào)通路之間是否存在相互影響，并協(xié)同影響乳腺癌轉(zhuǎn)移。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)在含5％CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系。
　　2.采用Western-blot的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)4種不同病理類型的乳腺癌細(xì)胞系中GPR30蛋白表達(dá)情況。
　　3.采用免疫熒光染色實(shí)

5、驗(yàn)方法檢測(cè)GPR30在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468中的定位。
　　4.采用Western-blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)隨著雌二醇（E2)及GPR30特異性激動(dòng)劑（G1）的刺激濃度梯度及時(shí)間梯度的增加，MDA-MB-468細(xì)胞p-PI3K的蛋白表達(dá)水平。
　　5.采用Western-blot的方法檢測(cè)使用GPR30特異性阻斷劑（G15）阻斷E2和G1對(duì)GPR30的活化效應(yīng)后，MDA-MB-468細(xì)胞內(nèi)p-PI3K的蛋白表達(dá)水平

6、。
　　6.采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GPR30-PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)腫瘤遷移能力的影響。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用x±s表示,組間比較采用單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：14種乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468、MCF-7、MDA-MA-231及MDA-MB-453， Western blot法檢測(cè) GPR30的蛋白

7、表達(dá)量分別為0.74±0.065、0.92±0.06、0.22±0.04、0.59±0.045；從結(jié)果可看出，三陰性MDA-MB-468細(xì)胞及ER陽(yáng)性的MCF-7中GPR30高表達(dá)，而另一種三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MA-231則幾乎不表達(dá)（P<0.05）。2由免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，GPR30主要位于細(xì)胞的胞質(zhì)中。3 E2濃度梯度為0ng5ng10ng20ng，刺激MDA-MB-468細(xì)胞后p-PI3K蛋白表達(dá)水平分別為：0.98±0

8、.06、1.18±0.061、1.40±0.086、1.5±0.025；E2時(shí)間梯度為0min、5min、10min、20min，p-PI3K蛋白表達(dá)水平分別為：0.96±0.042、1.17±0.04、1.49±0.031、0.74±0.056； G1濃度梯度為0nM1nM10nM100nM，刺激MDA-MB-468細(xì)胞后p-PI3K蛋白表達(dá)水平分別為：0.96±0.08、1.17±0.042、1.33±0.036、1.47±0.05

9、9；G1時(shí)間梯度為0min、5min、10min、20min，p-PI3K蛋白表達(dá)水平分別為：0.92±0.035、1.18±0.026、1.44±0.122、0.75±0.049。統(tǒng)計(jì)分析得出，隨著GPR30激動(dòng)劑濃度及時(shí)間的增加，p-PI3K蛋白表達(dá)水平也逐漸增加，并具有濃度及時(shí)間依賴性（P<0.05）；此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：激動(dòng)劑活化GPR30后，很可能反式激活了EGFR下游PI3K/Akt信號(hào)通路，使p-PI3K蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而參與

10、促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。4通過(guò)Western blot法檢測(cè)Control、E2處理組、G1處理組、E2+G15處理組、G1+G15處理組各組p-PI3K蛋白半定量水平分別為：0.95±0.04、1.43±0.05、1.42±0.03、0.58±0.06、0.62±0.10；實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，E2及G1處理組p-PI3K蛋白表達(dá)顯著升高，而加入GPR30特異性阻斷劑G15的處理組p-PI3K蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），此實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了G

11、PR30與PI3K/Akt信號(hào)通路之間可能存在某種相互關(guān)系。5劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)分組為control、E2處理組、G1處理組、E2+G15處理組、 E2+LY294002處理組、G1+G15處理組、G1+LY294002處理組，各組細(xì)胞遷移距離分別為（55.33±11.37）μm、(263.67±19.76)μm、(272.33±9.29)μm、(51.67±3.51)μm、(49.33±4.04)μm、(55.67±4.04)μm、(56.3

12、3±8.50)μm；由此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出， E2及G1處理組與對(duì)照組相比細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)（P<0.05），而不論是使用GPR30特異性阻斷劑阻斷GPR30的活化效應(yīng)還是使用PI3K抑制劑阻斷磷酸化PI3K的作用，都可明顯減弱細(xì)胞遷移能力（P<0.05）；此結(jié)果提示，GPR30-PI3K/Akt信號(hào)通路的活化可影響乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)論：
　　1.隨著激動(dòng)劑E2和G1刺激濃度梯度及時(shí)間梯度的升高，P-PI3K蛋白表

13、達(dá)水平也逐漸升高，提示GPR30與PI3K/Akt信號(hào)通路之間確實(shí)可能存在某種相互關(guān)系。
　　2.E2及G1活化GPR30后，可反式激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移能力；但通過(guò)抑制劑抑制GPR30或者PI3K的活化效應(yīng)，阻斷這一信號(hào)通路后，腫瘤細(xì)胞遷移能力則明顯減弱。
　　3.綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們初步證實(shí)，GPR30與PI3K/Akt信號(hào)通路之間可能通過(guò)某種方式存在交叉關(guān)系，并進(jìn)一步對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響