胃癌PI3K-AKt-mTOR信號傳導通路的協(xié)同與耐藥機制.pdf

1、第一部分依維莫司聯(lián)合MK2206對PTEN缺失胃癌細胞的協(xié)同作用
　　背景:晚期胃癌患者治療效果較差，中位生存期僅一年左右，急需新的方法來改善這類患者預后，而分子靶向治療是近年來發(fā)展最快的治療策略。哺乳動物雷帕霉素靶點(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制劑依維莫司(Everolimus，RAD001)是靶向mTORC1的化合物，臨床前研究提示依維莫司可以負反饋地引起上游絲氨酸蘇氨酸蛋白酶Ak

2、t的激活，從而影響抗腫瘤效果。本研究將觀察加入Akt抑制劑劑MK2206后是否能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，增強抗腫瘤效果，并進一步闡明兩藥協(xié)同的機制。
　　方法:我們首先從6株人胃癌細胞株中篩選出一株對依維莫司敏感的細胞株作為研究對象，檢測依維莫司和MK2206單藥或兩藥聯(lián)合后對細胞增殖抑制、細胞周期阻滯、細胞凋亡、細胞自噬的影響以及對mTOR通路上游及下游相關蛋白、ERK/MAPK通路相關蛋白、細胞周期蛋白、自噬相關蛋白表達水平的影響。<

3、br>　　結果:我們的研究顯示，依維莫司和MK2206能夠協(xié)同地作用于PTEN(phosphatase and tensin homolog)突變的胃癌HGC-27細胞株，在細胞周期阻滯、細胞增殖抑制和誘導細胞死亡上均具有協(xié)同作用。依維莫司和MK2206所導致的細胞死亡并非由于細胞凋亡，兩藥作用于HGC-27細胞后可協(xié)同引起自噬微管相關蛋白輕鏈3B(LC3B)抗體和自噬相關基因beclin-1的表達，提示這種細胞死亡可能是自噬性細胞死亡

4、。在依維莫司聯(lián)合MK2206處理細胞的同時加入自噬抑制劑3甲基腺嘌呤和氯喹，死亡細胞減少，這進一步提示細胞自噬性死亡，而非凋亡性死亡在依維莫司和MK2206共同作用導致的細胞死亡中占主要作用。在機制研究中，我們發(fā)現(xiàn)依維莫司與MK2206的聯(lián)合強化了對Akt/mTOR通路的抑制、對細胞周期蛋白D1(cyclin D1)下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)了細胞ERK/MAPK通路的激活。用MEK/ERK抑制劑PD98059和U0126可以抑制依維莫司聯(lián)合MK20

5、206引起的beclin-1的表達、自噬作用以及HGC-27細胞的死亡;用beclin-1 siRNA可以抑制細胞自噬，但對MAPK的表達沒有影響。
　　結論:PETN缺失的胃癌細胞對依維莫司較為敏感;依維莫司聯(lián)合MK2206能夠?qū)GC-27細胞產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，其機制中包含了ERK依賴的細胞自噬性死亡通路。
　　第二部分導致依維莫司耐藥的關鍵信號通路
　　背景:以往的臨床研究證明，依維莫司在胃癌中的療效還不夠理想

6、，治療有效的胃癌患者很容易產(chǎn)生對依維莫司的繼發(fā)性耐藥。由于mTOR處于PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路的中心位置，與細胞內(nèi)許多其他信號通路均有聯(lián)系，因此在胞內(nèi)尋找其關鍵耐藥機制難度較大，本研究將首先從位于胞膜的酪氨酸激酶受體入手，初步探索引起敏感胃癌細胞株HGC-27對依維莫司耐藥的關鍵信號通路。
　　方法:我們首先通過加藥誘導培養(yǎng)出穩(wěn)定的耐依維莫司(RAD001)的HGC-27細胞（HGC-27-resistant to

7、RAD001，HGC-27-RR），然后用高通量蛋白芯片篩選出這兩株遺傳學背景相同的細胞的差異表達蛋白，之后挑選出部分差異表達的位于胞膜的酪氨酸激酶受體，驗證這些差異蛋白是否介導了HGC-27細胞對依維莫司的耐藥。
　　結果:高通量蛋白芯片篩選的結果顯示，與HGC-27細胞相比，HGC-27-RR細胞中EGFR，PDGFR，F(xiàn)GFR，VEGFR的某些位點的磷酸化增多。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HGC-27-RR磷酸化FGFR1的表達較HGC

8、-27明顯高，并且用FGFR1的抑制劑TSU68可以明顯抑制HGC-27-RR細胞的生長。這提示FGFR1通路可能在HGC-27細胞對依維莫司耐藥的過程中起了重要的作用。在功能驗證中，我們發(fā)現(xiàn)用bFGF刺激HGC-27細胞后可以引起該細胞對依維莫司的耐藥，并且FGFR抑制劑AZD4547可以逆轉由bFGF介導的HGC-27對依維莫司的耐藥。
　　結論:FGFR通路激活在HGC-27細胞對依維莫司產(chǎn)生繼發(fā)耐藥的過程中起了重要作用，但