局部低劑量X線輻照對(duì)BMSCs向周圍神經(jīng)損傷部位歸巢影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及染色
　　目的：掌握骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及染色的方法，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步分析。
　　方法：大鼠處死消毒后，無菌操作取出大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，暴露骨髓腔，用L-DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液，離心，棄上清，重懸后計(jì)數(shù)，接種于的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、飽和濕度、5％C02條件下培養(yǎng)，應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)結(jié)合差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞分離純化。待細(xì)胞達(dá)85%-90%融合時(shí)，胰

2、酶消化傳代，倒置相差顯微鏡下觀察各代細(xì)胞的生長及形態(tài)變化。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)進(jìn)行鑒定。細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察并測(cè)繪細(xì)胞生長曲線圖。使用CFDA SE染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記。
　　結(jié)果：原代細(xì)胞接種培養(yǎng)后2h后，可觀察到部分細(xì)胞開始貼壁，多呈圓形，折光性較強(qiáng)。1天后可見貼壁細(xì)胞增多，常呈圓形、橢圓形，少量梭形。3天后貼壁細(xì)胞逐漸呈長梭形、三角或多邊形，多形成5-10個(gè)細(xì)胞的簇狀細(xì)胞團(tuán)。2-4天后細(xì)胞呈克隆樣生長，增殖緩慢，細(xì)胞形態(tài)

3、逐漸趨于梭形、長梭形，也有少量圓形細(xì)胞及多角形細(xì)胞。第5-8天時(shí)細(xì)胞克隆樣生長快速，簇狀細(xì)胞集落迅速增多，并向周圍不斷擴(kuò)大。原代培養(yǎng)第10-14天細(xì)胞集落可達(dá)85%-90%融合，通常表現(xiàn)為魚群狀、旋渦狀，即可傳代。P2、P4、P6代細(xì)胞的生長增殖曲線相接近。取生長狀態(tài)均一良好的P4代BMSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞法進(jìn)行 BMSCs表面抗原標(biāo)志物鑒定結(jié)果為：CD34(0.8%)、CD45(1.3%)陰性；CD29（93.7%）、CD90(99.

4、8%)陽性。
　　結(jié)論：應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)結(jié)合差速貼壁法能在體外簡(jiǎn)單、快速的分離和純化大鼠BMSCs，且增殖迅速、性狀穩(wěn)定。
　　第二部分局部低劑量X線輻照對(duì)BMSCs向周圍神經(jīng)損傷部位歸巢影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：設(shè)計(jì)在小間隙吻合法修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的基礎(chǔ)上，結(jié)合局部低劑量 X線輻照，通過大鼠尾靜脈移植BMSCs，觀察低劑量X線輻照對(duì)BMSCs向周圍神經(jīng)損傷部位歸巢的影響，并探討其可能的機(jī)制。
　　方法：采用健康清潔

5、級(jí)2月齡雄性SD大鼠60只，體重250-300g，經(jīng)小間隙吻合法制成周圍神經(jīng)損傷修復(fù)模型后，隨機(jī)均分為2組，實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后24h行局部1 Gy的X輻照，對(duì)照組不予以照射；低劑量輻照干預(yù)后1小時(shí)，兩組大鼠均經(jīng)尾靜脈移植BMSCs。分別于BMSCs移植后24h、48h、96h每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各選取6只大鼠，制作冰凍切片，熒光顯微鏡觀察比較兩組的BMSCs歸巢差異。并通過大鼠一般狀態(tài)、光鏡下神經(jīng)大體形態(tài)、坐骨神經(jīng)指數(shù)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、組織學(xué)和免

6、疫組織化學(xué)、神經(jīng)透射電鏡的超微結(jié)構(gòu)觀察比較兩組大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：
　　1、各時(shí)段大鼠坐骨神經(jīng)冰凍切片后熒光顯微鏡下對(duì)比觀察BMSCs歸巢數(shù)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組：24h(+++)；48h(++)；96h（++）。對(duì)照組：24h(++)；48h(+)；96h(-)。低劑量X線輻照干預(yù)后的實(shí)驗(yàn)組的BMSCs歸巢數(shù)明顯多于對(duì)照組，且表現(xiàn)為細(xì)胞移植后24h歸巢數(shù)最多，隨后下降。
　　2、大體觀察：（1）兩組大鼠均在術(shù)后

7、出現(xiàn)患肢癱瘓，各足趾并攏，不能主動(dòng)展開，踝及足趾下垂致使足背或趾尖觸地拖行。實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后均未出現(xiàn)足部潰瘍及自噬現(xiàn)象。而對(duì)照組大鼠術(shù)后2周有4只出現(xiàn)足跟部潰瘍，至第4周潰瘍完全愈合，無肢體自噬現(xiàn)象。（2）患肢自主活動(dòng)恢復(fù)情況：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3周開始患肢自主活動(dòng)，對(duì)照組術(shù)后5周開始恢復(fù)自主活動(dòng)。
　　3、顯微鏡下神經(jīng)吻合口形態(tài)觀察：實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)損傷處與周圍組織粘連明顯輕于對(duì)照組，且直徑與正常神經(jīng)干無明顯差異；而對(duì)照組神經(jīng)直徑較正常神經(jīng)干

8、稍細(xì)，且吻合口處表面可見的新生毛細(xì)血管明顯少于實(shí)驗(yàn)組。
　　4、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）：兩組大鼠SFI都表現(xiàn)為逐漸恢復(fù)，術(shù)后4周、8周、12周各時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組SFI恢復(fù)均優(yōu)于對(duì)照組，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　5、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察：（1） HE染色：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均可見神經(jīng)纖維通過小間隙到達(dá)遠(yuǎn)端。實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)纖維排列、單位面積再生神經(jīng)纖維密度、軸突腫脹程度等情況均優(yōu)于對(duì)照組。（2）免疫組織化學(xué)：實(shí)驗(yàn)組

9、抗S-100（+++），對(duì)照組抗S-100（++）。實(shí)驗(yàn)組雪旺氏細(xì)胞增生明顯，雪旺氏細(xì)胞數(shù)目較多。而對(duì)照組相對(duì)較少。
　　6、神經(jīng)電生理檢測(cè)：兩組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度都有不同程度的恢復(fù)，實(shí)驗(yàn)組在6周、12周時(shí)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度及波幅均高于對(duì)照組，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　7、透射電鏡觀察：每高倍顯微鏡視野下實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)纖維數(shù)量、軸突直徑、髓鞘形態(tài)、神經(jīng)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)均優(yōu)于對(duì)照組。
　　結(jié)論：通過尾靜脈移植的