生物鐘紊亂及吸煙致動脈粥樣硬化機制的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一組稱為動脈硬化的血管病中最常見、最重要的一種，可波及全身動脈血管，以大、中動脈最常見。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見的類型，已經(jīng)成為全世界致死率位居第一的疾病，遠遠超過惡性腫瘤對人類的威脅。因此如何有效抑制動脈粥樣硬化的進展，預防冠心病的發(fā)生，已成為亟待解決的問題。目前通過Framingham研究及大型流行病學調查，已明確了其諸多冠心病危險因素，比如吸煙

2、、肥胖、高血壓、高血脂、年齡、糖尿病、靜息生活方式，以及高尿酸血癥、高同型半胱氨酸血癥等。目前，生物鐘紊亂對冠心病的影響越來越受重視。研究表明，生物鐘周期異常可能直接影響心率、血壓、激素水平、自主神經(jīng)功能以及血液成分，導致多種心血管疾病，降低心臟功能，對健康產(chǎn)生重大危害。代謝綜合征(Metabolic syndrome，MS)是一組以肥胖、高血糖、血脂異常以及高血壓等聚集發(fā)病的臨床癥候群，是多種心血管疾病(cardiovascular

3、disease，CVD)的危險因素在同一個體聚集的病理狀態(tài)。我國的研究結果顯示，代謝綜合征患者10年心血管病危險性較非代謝綜合征增加了1.85倍。正常的生物鐘節(jié)律對機體代謝的調節(jié)有重要的臨床意義，而慢性的生物節(jié)律紊亂，比如倒班工作，與胰島素抵抗、肥胖、代謝綜合征和糖尿病等的高患病率密切相關。Bmal1(brain and muscle Arnt-like protein)基因，又稱為MOP3或ARNT3，是其中的一種生物鐘子鐘基因，是維

4、持生物鐘節(jié)律性振蕩的關鍵基因。源于染色體免疫共沉淀測序分析，在小鼠肝臟中，時間解析的全基因組Bmal1結合圖顯示碳氫化合物代謝是這一生物鐘的主要輸出。骨骼肌是胰島素依賴的血糖處理的主要部位，但肌肉生物鐘在調節(jié)糖攝入及代謝方面特殊的作用還無從知道。本研究即是通過小鼠骨骼肌特異性敲除Bmal1研究其對肌肉本身及整體血糖及脂肪代謝的影響，從而在代謝方面探討生物鐘紊亂引發(fā)動脈粥樣硬化的機制。
　　研究表明，吸煙是心血管疾病的主要危險因子。

5、據(jù)文獻報道，吸煙20min即可損傷冠狀動脈血管內皮，而冠狀動脈粥樣硬化病變的早期主要發(fā)生在冠狀動脈的內皮細胞。但吸煙對血管內皮損傷的機制尚待進一步研究。受損的血管內皮細胞作為一個動脈粥樣化形成的病灶，顯示了細胞粘附分子比如ICAM-1和VCAM-1表達的增長。確切的證據(jù)表明在對于各種刺激的炎癥反應中p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路(p38MAPK)擔負著一個關鍵的角色。然而p38MAPK信號通路在粘附分子在內皮細胞表面表達方面的影響還沒

6、有被探討。本研究即是通過觀察尼古丁對小鼠心臟血管內皮細胞ICAM-1和VCAM-1表達的影響，進一步明確吸煙對冠心病的致病機理，并探討p38MAPK在細胞粘附分子表達中的作用。
　　研究表明，吸煙可以影響HRV及皮質醇的分泌節(jié)律，這說明吸煙與生物鐘節(jié)律有關，可以通過影響生物鐘節(jié)律導致體內的一系列變化。吸煙亦與代謝綜合征有密切關系。現(xiàn)有資料證明，p38MAPK參與了生物鐘基因的表達及晝夜節(jié)律的輸入和輸出。
　　由此可見，生物鐘

7、紊亂、吸煙和代謝綜合征緊密相關，三者可能相互影響起到協(xié)同作用。而p38MAPK可能是其中的關鍵信號通路。因此，本研究在分別觀察生物鐘紊亂及吸煙導致動脈粥樣硬化的致病機制的同時，進一步探討兩者之間的相互影響及內在聯(lián)系，從而闡明其致病原因。
　　第一部分骨骼肌內在生物鐘Bma11缺乏對肌肉本身代謝的影響
　　目的:觀察骨骼肌選擇性敲除Bmal1對肌肉糖脂代謝的影響及相關基因及酶的改變，并進一步探討其機制。
　　方法:骨骼肌

8、選擇性敲除Bmal1小鼠為觀察對象，Bmal1-/-小鼠(B6.129-Arntltm1Bra/J)由Jackson實驗室提供，為實驗組，記為KO組(MCK-Cre+/BMfl/fl)，控制組為WT組(MCK-Cre-/BMfl/fl)。KO組及WT組根據(jù)進食狀態(tài)不同又分為禁食組(Fasting組)，禁食后飼喂組（Refed組）。每組小鼠5-6只。均給予持續(xù)的12∶12光照黑暗循環(huán)，光照開始時間于7:00a.m.，記為ZT0。8-12周

9、齡的小鼠被用來研究。分離生長10周的WT組和KO組小鼠的后肢肌肉TA、Soleus和GN，肝臟，下丘腦，用qRT-PCR、免疫印跡法、組織免疫熒光法觀察比較以下基因及蛋白的表達:1、生物鐘基因Bmal1、Rev-erbα;2、糖脂代謝相關基因MCAD、CPT-1b、LPL、FAS、Glut4、PDK4。分別從WT組和KO組生長4周的小鼠的后肢肌肉分離原代成肌細胞進行培養(yǎng)，用細胞免疫熒光染色及qRT-PCR觀察比較兩組間細胞分化情況及肌生

10、成相關基因Mck、Myf5、Myogenin、MLC1、Myh3的表達。用核磁共振成像技術評估10周時兩組間肌肉的質量。分離生長10周的WT組和KO組后肢肌肉TA、EDL，測定TA、EDL的脂肪酸氧化率和葡萄糖氧化率。分離生長10周的WT組和KO組后肢肌肉TA，行免疫組織化學熒光染色及免疫印跡，比較MyHC IIA和MyHC IIB的表達情況。
　　結果:KO組原代成肌細胞的分化、各成肌細胞相關基因的表達未受影響，總肌肉占體重百分

11、比及單個肌肉占體重百分比未受影響。在正常小鼠中，禁食后飼喂狀態(tài)下Glut4蛋白、Bmal1蛋白在比目魚肌及肝臟中表達明顯增加;在禁食狀態(tài)下，Rev-erbα蛋白和PDK4蛋白在脛前肌及比目魚肌表達增加。在禁食后飼喂狀態(tài)下，KO組PDK4蛋白表達水平在TA和Soleus中均顯著增加，Glut4蛋白表達水平在TA和Soleus中均顯著減少;而在禁食狀態(tài)下，PDK4和Glut4的蛋白表達水平兩組間未見明顯差異。qRT-PCR分析PDK4、MC

12、AD、CPT-1b也表現(xiàn)出了同樣的趨勢(P＜0.05)。KO組骨骼肌的葡萄糖氧化水平減低，而脂肪酸β-氧化水平增加(P＜0.05)。應用qRT-PCR分析了兩組在9AM(ZT2)和5PM(ZT10)時有關葡萄糖和脂肪酸代謝基因的在TA中的表達水平，結果顯示與脂肪代謝有關的基因MCAD與CPT-1b在9AM時KO組表達明顯增加，而PDK4在9AM及5PM時均明顯增加。應用免疫組織化學及免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，KO組脛前肌(TA)中的肌纖維MyH

13、C IIA增加，而MyHC IIB減少。
　　第二部分骨骼肌內在生物鐘Bmal1缺乏對全身代謝的影響
　　目的:觀察骨骼肌選擇性敲除Bmal1對機體整體糖脂代謝的影響，并進一步探討肥胖形成的機制。
　　方法:骨骼肌選擇性敲除Bmal1小鼠為觀察對象，Bmal1-/-小鼠(B6.129-Arntltm1Bra/J)由Jackson實驗室提供，為實驗組，記為KO組(MCK-Cre+/BMfl/fl)，控制組為WT組(MCK

14、-Cre-/BMfl/fl)。KO組及WT組根據(jù)進食狀態(tài)不同又分為禁食組(Fasting組)，禁食后飼喂組（Refed組）。根據(jù)飲食類型KO組及WT組又分為普食飼養(yǎng)組(Chow)及高脂飼養(yǎng)組(HFD)。每組小鼠5-6只。均給予持續(xù)的12∶12光照黑暗循環(huán)，光照開始時間于7:00a.m.，記為ZT0。8-12周齡的小鼠被用來研究。取WT組及KO組眼球后靜脈血，比較兩組在Refed和Fasting狀態(tài)下血清游離脂肪酸(FFA)、甘油(Gly

15、cerol)、甘油三酯(Triglyceride)血糖(Glucose)、膽固醇(Cholestorel)水平。分離小鼠肝臟，包括Refed和Fasting組、Chow組和HFD組，行肝臟甘油三酯提取測定含量及油紅O染色，比較在不同條件下WT組和KO組肝臟脂肪含量。比較WT組和KO組在Chow和HFD情況下體重的變化，觀察4-12周。比較WT組和KO組在禁食0、12、24、36小時時體內脂肪含量的變化。用ComprehensiveLab

16、 Animal Monitoring System(CLAMS)測定兩組的呼吸交換率、氧消耗量、總體活動水平。
　　結果:結果顯示在禁食狀態(tài)下(Fasted)，KO組循環(huán)中的游離脂肪酸(FFA)、甘油(Glycerol)和甘油三酯(Triglyceride)水平均明顯降低，分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01;而血糖水平顯著升高，P＜0.01。在禁食后飼喂狀態(tài)下(Refed，4hrs)，兩組間以上指標無明顯差異。KO組肝

17、臟中的甘油三酯(Triglyceride)含量在禁食狀態(tài)下明顯減少，P＜0.01。肝臟切片的油紅O染色(oil-red-O staining)圖像顯示，在禁食狀態(tài)下，WT組肝臟脂肪滴明顯增多，而KO組肝臟脂肪滴明顯較少。無論是普食飼喂組還是高脂飼喂組，在9AM時KO組肝臟中甘油三酯(TG)含量均明顯減少(P＜0.01)，肝臟切片的油紅O染色也顯示出了同樣的趨勢。在高脂飼喂組，KO組在12周時體重明顯減低，P＜0.01;體脂含量在4周和1

18、2周時均表現(xiàn)出了明顯減低，分別為P＜0.05，P＜0.01。發(fā)現(xiàn)在禁食12小時、24小時、36小時時KO組體脂的含量均明顯少于WT組，分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05。兩組間呼吸交換率、每天的食物攝入量、每小時的氧消耗量、總體活動水平無明顯差異。
　　第三部分尼古丁經(jīng)由p38 MAPK信號通路誘導ICAM-I和VCAM-1在小鼠心臟血管內皮細胞的表達
　　目的:探討吸煙對血管內皮細胞炎性標志物ICAM-1和VC

19、AM-1的影響及p38 MAPK信號通路在其中的作用。
　　方法:分離小鼠的心臟血管內皮細胞進行培養(yǎng)，第3至5代細胞被用來作為尼古丁暴露。用三種不同濃度的尼古丁進行處理，濃度分別為10-5，10-6和10-7 M，實驗證明當小鼠的心臟血管內皮細胞暴露在10-6 M尼古丁的濃度下8個小時，ICAM-1和VCAM-1的活性達到了峰值。我們用10-6 M濃度的尼古丁進行隨后的實驗。將培養(yǎng)的心臟血管內皮細胞分兩組，一組用10-6 M濃度的

20、尼古丁處理細胞，另一組用10μM濃度的p38MAPK抑制劑(SB203580)預處理小鼠的心臟血管內皮細胞30分鐘，然后再用10-6 M濃度的尼古丁處理細胞。處理后提取兩組細胞的RNA及蛋白，用qPCR及免疫印跡法比較兩組ICAM-1和VCAM-1的表達。
　　結果:結果顯示尼古丁通過p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路增強了細胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1在小鼠心臟血管內皮細胞的表達。
　　結論:本研究發(fā)現(xiàn)肌肉Bmal1

21、的基因消融導致了代謝向脂肪氧化的方向轉移，減少了肌肉對糖的攝取和利用，引發(fā)了胰島素抵抗，缺少了正常狀態(tài)下能量代謝在休息/空腹狀態(tài)下以脂肪代謝為主向活動/飼喂狀態(tài)下以糖代謝為主轉變的這一正常的生理現(xiàn)象，并促使肌纖維的組成類型發(fā)生了相應的變化。肌肉中增強的脂肪氧化反過來阻止了肝臟中脂質的聚集而促進了脂肪組織中脂肪的動員。由于過量的甘油供應用于肝臟的糖異生而同時減少了肌肉中糖的利用，導致了循環(huán)中葡萄糖水平的升高而甘油三酯和游離脂肪酸的水平降低

22、，進而抑制了高脂飲食導致的肥胖。
　　因此我們可以推斷Bmal1功能的增強可能會造成相反的結果，即胰島素敏感性增加，從而導致了糖利用增加，抑制了脂肪酸β-氧化，而體內脂肪的過度積累造成了脂肪肝的形成及肥胖。
　　本研究通過觀察尼古丁對小鼠心臟血管內皮細胞ICAM-1和VCAM-1表達的影響，證明了10-6M的尼古丁在8小時時最大程度上增加了ICAM-1和VCAM-1在小鼠心臟血管內皮細胞的表達。我們的結果提供了一個推定的機制

23、即尼古丁通過p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路刺激了這些粘附分子的表達。
　　綜上所述，Bmal1功能的缺失，將導致胰島素抵抗，升高循環(huán)中血糖的水平，而Bmal1功能的增強可能會抑制脂肪的氧化，導致循環(huán)中血脂水平增高及機體脂肪的蓄積，及無論Bmal1的功能是減低還是增強，都可能導致機體糖脂代謝的異常，從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生;而尼古丁通過p38MAPK信號通路刺激了心臟血管內皮細胞粘附分子表達的增加，從而促發(fā)了血管內皮細胞的炎癥反