apoE基因敲除動脈粥樣硬化小鼠中樞、心臟和肝臟生物鐘基因表達改變的研究.pdf

1、晝夜節(jié)律生物鐘(circadian clock)參與機體各項生理功能的調(diào)節(jié),如血脂、血壓、碳水化合物代謝、激素(包括胰島素、瘦素、糖皮質(zhì)素等)分泌、凝血因子分泌以及進食行為等,晝夜節(jié)律產(chǎn)生的分子基礎來源于生物鐘基因(circadian gene)之間的協(xié)調(diào)表達,即轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路。中樞生物鐘基因位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN),外周組織也有類似的生物鐘基因表達,而對生理功能的調(diào)節(jié)是各鐘基因

2、通過調(diào)控下游鐘控基因(clock-controlled genes,CCGs)的表達來實現(xiàn)的。已有研究表明一些鐘基因表達的改變參與到疾病的發(fā)生發(fā)展,如心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等。
　　 在心血管系統(tǒng)疾病中,急性心肌梗塞(acute myocardial infarction)、中風(stroke)和心源性猝死(sudden cardic death)發(fā)病具有明顯的晝夜節(jié)律,在早晨高發(fā)。其發(fā)病機制目前尚不清楚。這些疾病主

3、要是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的終末期并發(fā)癥。動脈粥樣硬化是一種多因素參與的慢性疾病,其病因復雜包括炎癥、細胞凋亡與增殖、脂質(zhì)代謝紊亂等。其中脂質(zhì)代謝紊亂是其重要的代謝性危險因素。在正常情況下,生物鐘通過調(diào)控下游與脂質(zhì)代謝相關鐘控基因的表達,參與脂質(zhì)代謝。當這個調(diào)控通路發(fā)生異常時,可引起血脂異常,胰島素抵抗,肥胖,高血壓等。血清中血脂增高尤其氧化型LDL的升高促使一些炎癥介質(zhì)、自由基釋放增加,影響內(nèi)皮細胞功能,

4、引起血管壁炎癥,易于脂質(zhì)沉積于內(nèi)皮下,炎癥因子如血管細胞粘附分子-1、E-選擇素等促使單核細胞進入內(nèi)皮下,分化為巨噬細胞,吞噬脂質(zhì)后轉(zhuǎn)化成泡沫細胞,促進脂紋的形成,內(nèi)皮細胞的過度凋亡,使得脂質(zhì)沉淀增多,斑塊增大,血管平滑肌的凋亡不足,使得血管壁增厚變硬,斑塊易于破裂,導致血栓性疾病的發(fā)生。同時生物鐘基因還參與細胞凋亡與增殖、炎癥反應、凝血功能、血壓等的調(diào)控,而這些功能的異常與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關,那么作為動脈粥樣硬化危險因素之一的脂質(zhì)

5、代謝紊亂是否對生物鐘基因的表達有影響?目前國內(nèi)外的報道較少,我們以往的研究發(fā)現(xiàn),apoE基因敲除(apoE-/-)動脈粥樣硬化小鼠模型中,心臟生物鐘基因和鐘控基因表達紊亂。有研究表明,高脂飲食能夠影響小鼠生物鐘基因的表達,而生物鐘基因參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié),所以我們推測在apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化形成過程中,生物鐘基因表達節(jié)律的改變可能與脂質(zhì)代謝紊亂有關,生物節(jié)律的紊亂又影響脂質(zhì)的代謝,從而形成脂質(zhì)代謝的惡性循環(huán),導致動脈粥樣硬化的發(fā)生

6、發(fā)展。為此,我們利用apoE-/-小鼠,分別給予普通和高脂飲食,建立動脈粥樣硬化的早期和進展期動物模型,檢測與脂質(zhì)代謝密切相關的肝臟組織、與動脈粥樣硬化發(fā)生密切相關的心臟組織、參與調(diào)控各項生理功能的中樞組織鐘基因的表達節(jié)律變化,研究動脈粥樣硬化(AS)病理過程中引起生物鐘基因表達變化的機制,進一步研究脂質(zhì)代謝與生物鐘基因之間的關系,為研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。
　　 本課題采用36只3月齡的雄性apoE-/-小

7、鼠,分為兩組,每組18只,在12小時光照/12小時黑暗(L/D)的環(huán)境下飼養(yǎng)2周,后轉(zhuǎn)入12小時黑暗/12小時黑暗(D/D)環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)3周。一組給予普通飲食,一組給予高脂飲食,以18只同齡雄性C57BL/6J小鼠作為對照,根據(jù)Circadian Time(CT用來評估生物體內(nèi)在生物學時間,CT0被定為主觀性早晨,CT12被定為主觀性夜晚),分別在CT0、CT4、CT8、CT12、CT16、CT20六個時間點處死小鼠,檢測血清中總膽固

8、醇、LDL-CHO、HDL-CHO的含量;取小鼠主動脈起始段做冰凍切片,油紅O染色檢測動脈粥樣斑塊;利用Real-timePCR檢測普通飲食和高脂飲食apoE-/-與C57BL/6J小鼠中樞、心臟和肝臟鐘基因(mPer2,mBmall,mClock,mCryl,mRev-erbα)在不同時間點的表達變化。結(jié)果顯示給予普通飲食的apoE-/-小鼠尚未形成明顯的粥樣斑塊,但其主動脈內(nèi)皮下已經(jīng)形成脂肪泡沫細胞,血清總膽固醇和LDL-CHO明顯

9、增高,HDL-CHO則明顯降低;給予高脂飲食的apoE-/-小鼠主動脈有明顯的脂質(zhì)沉積,動脈粥樣硬化斑塊明顯,其血清總膽固醇和LDL-CHO更高,HDL-CHO含量更低。因此,給予普通飲食與高脂飲食的apoE-/-小鼠分別處于動脈粥樣硬化的早期與進展期。
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示:apoE-/-小鼠中樞、心臟中生物鐘基因除mClock外mper2,mBmall,mCryl和mRev-erbα mRNA水平的表達均

10、呈現(xiàn)晝夜節(jié)律,而在肝臟中的表達都表現(xiàn)出晝夜節(jié)律。
　　 在普通飲食和高脂飲食apoE-/-小鼠中樞生物鐘基因mRNA水平表達幅度無明顯變化,表達節(jié)律發(fā)生改變。在心臟中,普通飲食和高脂飲食的apoE-/-小鼠mPer2 mRNA表達高峰和低谷分別延后4小時,出現(xiàn)在CT12、CT0上,相對于C57BL/6J表達高峰和低谷在CT8、CT20;而mBmall的mRNA表達節(jié)律與之相反,呈反時相表達。與C57BL/6J小鼠中表達高峰和低谷

11、出現(xiàn)在CT20和CT8相比,普通飲食和高脂飲食的apoE-/-小鼠中其表達高峰和低谷分別延后4小時,出現(xiàn)在CT0和CT12。在高脂飲食的apoE-/-小鼠中,mCry1基因mRNA水平的表達在暗周期CT12,CT16,CT20上高于普通飲食的apoE-/-小鼠。在肝臟組織中apoE-/-小鼠mBmall,mPer2,mClock,mCrylmRNA水平在多個時間上表達震幅降低伴有節(jié)律改變。
　　 CT0時,普通飲食和高脂飲食的a

12、poE-/-小鼠mRev-erbα mRNA水平在中樞、心臟和肝臟的表達幅度均低于C57BL/6J小鼠,表達高峰與C57BL/6J小鼠相比分別延后4個小時,分別出現(xiàn)在CT8和CT12,表達低谷無明顯變化。
　　 結(jié)合本實驗以及本課題組以往實驗結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化apoE-/-小鼠多個生物鐘基因和許多動脈粥樣硬化相關的生物鐘調(diào)節(jié)基因表達發(fā)生變化,推測可能存在某個或某些轉(zhuǎn)錄因子的表達改變,導致生物鐘基因轉(zhuǎn)錄水平表達的紊亂。因此

13、,我們分析了數(shù)百個可能與上述生物鐘基因上游調(diào)控區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,其中mRev-erbα,mPPARα,mRXRα,mHNF-3α,mHNF-3β,mPPARγ出現(xiàn)頻率較高,而與脂質(zhì)代謝和心血管疾病密切相關的轉(zhuǎn)錄因子有mRev-erbα,mPPARα,mRXRα,,檢測他們在中樞、心臟和肝臟中mRNA水平的表達。結(jié)果顯示:作為生物鐘基因的mRev-erbα同時又是轉(zhuǎn)錄因子,在中樞、心臟和肝臟中mRNA水平表達節(jié)律和幅度都有變化。脂質(zhì)代謝相

14、關因子mPPARα,mRXRα在SCN、心臟的表達無明顯變化,在肝臟表達變化明顯。給予高脂飲食的apoE-/-小鼠中mPPARα,mRXRα mRNA水平的表達與普通飲食apoE-/-小鼠中的表達相比,在CT0,CT4,CT8上表達幅度明顯增高,大約2-6倍。
　　 綜上所述,在apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠模型中,中樞生物鐘基因表達幅度無明顯變化,表達節(jié)律發(fā)生變化。心臟生物鐘基因主要表現(xiàn)為表達峰值的延后伴有表達幅度的改變。而肝