miRNAlet-7c-5p對缺血性腦損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　研究腦內(nèi)高表達的microRNA，let-7c-5p對腦缺血再灌注損傷的保護作用，探究其保護作用的機制。
　　方法:
　　用線栓法建立小鼠局暫性大腦中動脈栓塞模型（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO），通過側(cè)腦室定位注射（I.C.V）let-7c-5p類似物（mimic）實現(xiàn)let-7c-5p的過表達，研究其對急性腦缺血再灌注損傷的作用。通過2,

2、3,5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）染色測定腦梗死體積。為了模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷對小膠質(zhì)細胞的影響，我們體外培養(yǎng)了原代小膠質(zhì)細胞和BV-2細胞，建立體外缺糖缺氧（OGD）再灌注模型，另外，我們還以脂多糖（LPS）和原代皮層神經(jīng)元缺糖缺氧再灌注的上清刺激原代小膠質(zhì)細胞和BV-2誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Real-time qPCR檢測急性期中風(fēng)病人血漿、缺血再灌注小鼠血漿、缺血再灌注小鼠皮層梗死半暗區(qū)與造模前

3、后小膠質(zhì)細胞內(nèi)let-7c-5p的表達；分別采用western blotting、ELISA和Real-time qPCR檢測由小膠質(zhì)細胞激活而引起的炎癥介質(zhì)的表達；通過免疫組化的方法檢測缺血再灌注損傷皮層半暗帶小膠質(zhì)細胞的激活情況。最后采用熒光素酶報告基因的方法檢測let-7c-5p的直接靶點。
　　結(jié)果:
　　相對于健康人，let-7c-5p在中風(fēng)病人血漿中表達顯著下調(diào)；在缺血再灌注損傷小鼠血漿和皮層梗死半暗區(qū)的表達也顯

4、著下調(diào)；和陰性對照組相比，過表達let-7c-5p組顯著減少tMCAO模型后梗死體積，并且可以明顯改善缺血引起的神經(jīng)功能缺失。同時，過表達let-7c-5p顯著抑制缺血半暗帶小膠質(zhì)細胞的激活，降低半暗帶iNOS、TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達水平。體外實驗結(jié)果近一步表明，let-7c-5p在不同刺激激活的小膠質(zhì)細胞中表達下調(diào)，過表達let-7c-5p可以顯著抑制各種刺激誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細胞激活所引起的iNOS、COX-2、

5、TNF-α和IL-6的mRNA蛋白的表達。過表達let-7c-5p可以顯著降低caspase3的mRNA和蛋白表達水平；和共轉(zhuǎn)染caspase3種子序列突變的突變型HEK293細胞相比，let-7c-5p過表達可以顯著降低共轉(zhuǎn)染野生型caspase3 HEK293細胞的熒光強度。同時，過表達let-7c-5p可以顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的總caspase3和剪切的caspase3的表達。
　　結(jié)論:
　　過表達let-7c-5p