卵巢早衰患者TBP2基因研究及助孕方式初探.pdf

1、早發(fā)性卵巢功能不全(POI)是一種多病因引起的女性在40歲前卵巢功能減退，臨床表現(xiàn)為停經(jīng)或月經(jīng)稀發(fā)4-6個月，間隔＞4周連續(xù)兩次卵泡刺激素(FSH)＞25 IU/L。近年來，業(yè)界普遍認為過去常用的卵巢早衰（POF）不能體現(xiàn)該疾病的發(fā)生發(fā)展過程，因而診斷標準中將FSH數(shù)值由＞40IU/L降至＞25IU/L。診斷閾值的下調意味著將有更多女性進入POI的管理范疇，以便盡早引起婦產(chǎn)科醫(yī)生的關注，讓POI患者得到及時的診斷與治療。據(jù)報道，POF的

2、發(fā)病率約為1％，中國女性中的發(fā)病率約為2.8％，該病對女性的健康及生育力會造成嚴重影響，導致不孕、骨質疏松、泌尿生殖器官萎縮、心血管疾病、認知功能減退及抑郁等，應在臨床上得到早期的診斷和干預，以提高患者的生活質量，目前該病已成為婦科生殖內(nèi)分泌領域研究的熱點。
　　由于本課題中進行基礎研究的病例樣本所屬者和臨床研究中跟蹤隨訪的患者均為近4-5年間就診者，且均是以FSH＞40IU/L作為診斷標準確診的卵巢早衰患者。因此，本文中相關疾病

3、的描述仍以“卵巢早衰(POF)”為主。
　　卵巢早衰的病因復雜多樣，包括遺傳學因素、免疫性因素、醫(yī)源性因素、代謝性因素以及病毒感染等。其中遺傳學因素被認為是首先需要關注的重要因素，包括染色體數(shù)目與結構異常，基因變異等。本課題以遺傳學因素作為卵巢早衰病因研究的切入點，在對已發(fā)表的與卵巢早衰發(fā)生相關的基因變異（包括基因多態(tài)性、基因突變等）相關性文獻進行大量閱讀分析的基礎上，篩選出TATA結合蛋白2(TBP2)這一基因。通過對近4年來已

4、收集的中國漢族女性特發(fā)性卵巢早衰病例樣本的相關實驗研究，探討TBP2基因是否參與卵巢早衰的發(fā)病。此外，在臨床研究方面，卵巢早衰所導致的不孕癥是育齡期女性面臨的嚴峻問題，本課題通過對確診為卵巢早衰性不孕癥但因有生育要求而采取輔助生殖技術（自然周期或微刺激周期的體外受精-胚胎移植）助孕的患者進行3-4年的跟蹤隨訪，經(jīng)過不同助孕方式及對應生育結局的比較，初步探討臨床上卵巢早衰患者不同助孕方式的效果及其與妊娠結局的相關性。通過上述的基礎研究，一

5、方面，進一步探索基因變異與卵巢早衰發(fā)病的相關性，為深入明確卵巢早衰的遺傳學病因提供一定的依據(jù)，從而為卵巢早衰的病因分析及早期診斷提供理論依據(jù)。另一方面，上述的初步臨床研究也為卵巢早衰性不孕癥患者通過選擇不同的方式助孕從而獲得較好的生殖結局提供了一些有價值的參考，進而為臨床應用中卵巢早衰的生育相關性診療提供指導依據(jù)。
　　第一部分卵巢早衰患者TBP2基因的相關研究
　　目的:前期研究報道提示，TBP2基因特異性表達在小鼠卵巢，

6、且該基因敲除的雌性小鼠是不孕的。本研究擬通過檢測中國漢族卵巢早衰女性中TBP2基因的7個外顯子，探討該基因與卵巢早衰發(fā)病的關系。
　　方法:研究對象為南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院門診就診并被確診的中國漢族特發(fā)性卵巢早衰患者60例及年齡匹配、月經(jīng)正常、性激素檢查在正常范圍的對照女性60名，收集其外周血樣本納入研究。采用血基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細胞中的DNA，并用UCSC ExonPrimer online software設

7、計針對TBP2基因的引物，應用聚合酶鏈式反應(PCR)特異性擴增TBP2基因所有7個外顯子的編碼區(qū)及其側翼序列，并對POF試驗組和對照組的TBP2基因擴增序列進行測序分析，所得序列利用核苷酸序列比對編輯工具以及哈代-溫伯格平衡定律(HWE)等進行綜合分析。關于TBP2基因錯義突變所致的潛在功能性或結構性影響則由基于ClustalX和PolyPhen2的程序進行預測。另外，應用卡方檢驗比較單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)的基因型和等位基因頻率

8、在卵巢早衰組及對照組間的分布情況。
　　結果:測序結果發(fā)現(xiàn)，在卵巢早衰組和對照組中均發(fā)現(xiàn)一個常見的單核苷酸多態(tài)性位點(c.92G＞ C)，兩組中該位點的基因型分布和等位基因頻率的比較也無統(tǒng)計學差異，且沒有結果表明出現(xiàn)合理的致病性突變。
　　結論:研究顯示，中國漢族女性中TBP2基因的SNP位點(e.92G＞ C)可能與特發(fā)性卵巢早衰的發(fā)生無關。
　　第二部分卵巢早衰性不孕患者助孕方式的臨床初探
　　目的:卵巢早衰

9、(POF)是一種復雜的生殖內(nèi)分泌疾病，育齡期的POF女性較難自發(fā)獲得妊娠。本研究擬通過分析50例應用自然周期IVF-ET（in vitrofertilization-embryo transplantation）方案或微刺激周期IVF-ET方案的POF性不孕癥女性的生育結局，評估這兩種輔助生殖方案的療效，進而探討臨床上該類病人不同助孕方式的效果。
　　方法:近4年來在南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖中心收集到POF性不孕癥的女性172

10、例（包括應用自然周期方案的74例和應用微刺激周期方案的98例），其中有50例患者在應用不同方案IVF-ET的助孕方式后成功妊娠。將此50例患者根據(jù)所采用的IVF治療方案分為A，B兩組，A組17人，為應用自然周期方案獲得妊娠，B組33人，為應用微刺激周期方案獲得妊娠。所有納入的患者均具有正常的染色體核型(46，XX)，已排除盆腔因素或其它系統(tǒng)性疾病所致的不孕，其伴侶均具有良好的生育能力。回顧性分析所有研究對象的年齡、初潮年齡、身體質量指數(shù)

11、(BMI)、不孕年限、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)，泌乳素(PRL)等性激素水平，雙側卵巢竇卵泡數(shù)(AFC)、甲狀腺功能以及她們的生育結局，從而評估不同助孕方式的療效。
　　結果:對于A、B兩組不孕癥患者，在進行輔助生殖技術(ART)治療前，血FSH水平均高于40 IU/L（符合POF的診斷標準）。基本情況方面，兩組患者在年齡、初潮年齡、BMI、不孕年限，妊娠次數(shù)及基礎竇卵泡數(shù)等方面均無明顯

12、差異。進一步發(fā)現(xiàn)，應用雌孕激素聯(lián)合序貫治療(HRT)三個月以上，檢測兩組患者的性激素水平，結果顯示，A，B兩組患者的血FSH、LH及E2水平分別為[A組:FSH(10.39±5.83) IU/L，LH(3.75±2.07) IU/L，E2(44.53±63.00) pg/ml。B組:FSH(12.18±6.06) IU/L,LH(4.19±1.80) IU/L,E2(43.40±61.35) pg/ml]，比較無顯著差異。此外，A組中含

13、有1例甲狀腺功能異常的患者而B組中有7例，A、B兩組中各包含一例高泌乳素血癥的病患者。生育結局方面，有14例患者應用自然周期方案后獲得臨床妊娠且均為活產(chǎn)，自然周期組的臨床妊娠率為18.9％(14/74)。有29例患者應用微刺激周期方案后獲得臨床妊娠，其中活產(chǎn)為25例，因而微刺激周期組的臨床妊娠率為29.6％(29/98)。比較發(fā)現(xiàn)，自然周期組和微刺激周期組在臨床妊娠率方面無明顯差異。除此之外，A組中患者中沒有流產(chǎn)或宮外孕發(fā)生，B組患者中