細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在心肌肥大中的動(dòng)態(tài)變化及雷公藤甲素的影響.pdf

1、心肌肥大(cardiac hypertrophy)的一個(gè)主要特征是心肌細(xì)胞體積增大，直徑增寬，及肌節(jié)數(shù)量增多，而細(xì)胞數(shù)目保持不變。盡管早期對(duì)心功能具有一定的代償作用，但長(zhǎng)期的心肌肥大會(huì)引起心肌耗氧量增加，導(dǎo)致心絞痛、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)病率和死亡率明顯增高，嚴(yán)重影響心血管疾病患者的預(yù)后，因而逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展已成為防治心血管疾病的重要舉措。
　　在哺乳動(dòng)物早期胚胎中，心肌細(xì)胞分裂活躍，以適應(yīng)心臟快速增長(zhǎng)的需

2、要。但出生后不久，周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)表達(dá)量均迅速降低，而CDK抑制因子(CDK inhibitor，CDKI)則快速增加，促使心肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期，成為一種高度分化的終末細(xì)胞。然而，大量的研究發(fā)現(xiàn)，在病理刺激下，成熟的心肌細(xì)胞能重返細(xì)胞周期，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子再度激活表達(dá)，共同促進(jìn)DNA和蛋白質(zhì)合成，但卻無(wú)法順利完成有絲分裂，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大。細(xì)胞周期是

3、在細(xì)胞周期正調(diào)控因子（cyclin-CDK復(fù)合物）和負(fù)調(diào)控因子(CDKI)共同調(diào)節(jié)下完成的。研究心肌肥大過(guò)程中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)于深入了解心肌肥大的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，以及尋找新的防治靶點(diǎn)具有重要價(jià)值。
　　雷公藤甲素(triptolide，TP)來(lái)源于雷公藤屬植物，具有調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子表達(dá)的作用。然而，TP對(duì)心肌細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的影響如何尚不明確。本課題旨在研究在心肌肥大過(guò)程中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的時(shí)相性表達(dá)變化及

4、TP對(duì)其表達(dá)的影響，探討通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期防治心肌肥大的可行性。
　　方法:
　　1.血管緊張素(angiotensinⅡ，AngⅡ)1.0μmol·L-1分別處理H9c2細(xì)胞5、10、30min，和1、2、3、6、12、24、48h，羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色并檢測(cè)細(xì)胞面積;real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白B1、D1、E1，CDK1、2、4、6，以及CDK抑制因子p21mRNA的表達(dá)變化情況。
　　2.分離培養(yǎng)

5、新生大鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat ventricular myocytes，NRVM)，AngⅡ分別處理5、10、30min和1、2、3、6、12、24h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。
　　3.同上方法采用AngⅡ處理NRVM，分別加入雷公藤甲素(triptolide，TP)1.0μg·L-1孵育不同時(shí)間。鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)細(xì)胞面積;real-time PCR法檢測(cè)β-肌球蛋白重鏈(myosin heavy chai

6、n，MHC)mRNA和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子mRNA的表達(dá)情況;Westernblot法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。
　　4.動(dòng)物模型建立及藥物干預(yù):健康清潔級(jí)雄性C57小鼠72只，隨機(jī)分為異丙腎上腺素組(isoprenaline，ISO)和TP治療組，各6個(gè)時(shí)相點(diǎn)，共12組(n=6)。ISO(10mg·kg-1，sc，bid)制備心肌肥大模型，TP（10μg·kg-1·d-1，ip，qd）分別處理0、1、3、7、14、21d。
　　5.密

7、切觀察小鼠生活狀況及死亡情況。末次給藥后，稱量體重(BW)和心重(HW)，測(cè)量小鼠脛骨長(zhǎng)度(TL)，以HW/TL作為心臟指數(shù)。分別采用HE和Masson染色觀察心肌組織病理變化與膠原沉積情況;麥胚凝集素染色觀察計(jì)算細(xì)胞平均面積。
　　6.采用real-time PCR法檢測(cè)β-MHC及細(xì)胞周期因子cyclin A2、B1、D1、E1，CDK1、2、4、6，p21、p27mRNA的表達(dá)變化情況;Western blot法檢測(cè)β-MH

8、C、cyclinD1、CDK4、CDK6、P21蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.隨著AngⅡ刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，H9c2細(xì)胞面積逐漸增大;細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子均于刺激后出現(xiàn)短暫反應(yīng)性表達(dá)增加，cyclin E1與CDK2、CDK4mRNA在5min時(shí)達(dá)到峰值，cyclin D1mRNA在10min時(shí)達(dá)到峰值，隨后一直呈減少趨勢(shì);CDK6與cyclin B1mRNA表達(dá)出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，分別于5和30min達(dá)第一峰，隨后表達(dá)減少，于2

9、h達(dá)最低點(diǎn)，接著又表達(dá)增加，于12h達(dá)第二峰。p21mRNA表達(dá)量于30min達(dá)峰值，隨后逐步減少，3h時(shí)表達(dá)最低，之后又緩慢增加。
　　2.與H9c2細(xì)胞相比，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，NRVM細(xì)胞肥大反應(yīng)更為明顯，6h后細(xì)胞面積增加呈加速趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，經(jīng)TP處理后，細(xì)胞面積升高趨勢(shì)明顯減弱。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，在AngⅡ刺激下，NRVM細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)減少，S+G2期的細(xì)胞數(shù)明顯增加。
　　3.AngⅡ處理5

10、min時(shí)，NRVM細(xì)胞β-MHC、cyclin A1、p21、p27mRNA出現(xiàn)反應(yīng)性小幅度表達(dá)增加;p21mRNA于30min達(dá)極大值。β-MHC mRNA于刺激6h表達(dá)最低，隨后其表達(dá)量隨刺激時(shí)間增加而驟升，于48h達(dá)最大值，這與細(xì)胞面積肥大結(jié)果相一致。此外，CDK1、2、4、6、cyclin B1、D1、p21mRNA均于2h表達(dá)最低，cyclin A1和p27mRNA表達(dá)量在1h時(shí)達(dá)最低位，cyclin E1mRNA于3h時(shí)表達(dá)

11、最低;之后隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞周期因子表達(dá)均出現(xiàn)回升，cyclin A1mRNA于3h表達(dá)達(dá)峰值;然而在AngⅡ刺激24～48h，僅CDK1、p21、p27mRNA表達(dá)升高較顯著(P＜0.01)，其它的周期正調(diào)控因子雖有緩慢增加，但均維持在較低水平;而TP在減小細(xì)胞面積的同時(shí)能夠糾正細(xì)胞周期因子mRNA的異常表達(dá)。
　　4.蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著AngⅡ處理時(shí)間增加，β-MHC、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)逐漸減少;而P21于刺

12、激30min短暫升高后又迅速降低，CDK4、P21均于2h達(dá)最低值，CDK6與β-MHC均于30min達(dá)最低位，而后隨刺激時(shí)間的增加而遞增;在AngⅡ刺激12～24h，所以蛋白表達(dá)均達(dá)到最大值。在細(xì)胞肥大過(guò)程中，就細(xì)胞周期因子在mRNA和蛋白水平上表達(dá)變化而言，AngⅡ?qū)Φ鞍妆磉_(dá)的影響較mRNA更明顯;而TP可明顯糾正上述細(xì)胞周期因子蛋白表達(dá)異常。
　　5.ISO處理組小鼠皮毛暗淡無(wú)光澤，呼吸急促，活動(dòng)較少，反應(yīng)遲鈍，隨著ISO作

13、用時(shí)間增加，上述反應(yīng)越明顯;與模型組相比，TP組小鼠活動(dòng)與進(jìn)食情況明顯改善。
　　6.ISO處理3d后，小鼠HW/TL比值開始顯著升高，細(xì)胞面積增大，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)增加，同時(shí)出現(xiàn)心肌纖維斷裂、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積。TP能明顯降低心臟指數(shù)，改善心肌組織損傷，減輕纖維化。
　　7.在ISO誘導(dǎo)小鼠心肌肥大過(guò)程中，β-MHC、cyclin D1、E1、CDK2、4、6mRNA表達(dá)逐漸減少，其中β-MHC、cyclin D1

14、、CDK6mRNA于1d時(shí)達(dá)最低值，cyclin E1、CDK2、4mRNA于3d時(shí)達(dá)谷值，隨后表達(dá)量均又逐漸升高;β-MHC mRNA于14d達(dá)峰值后表達(dá)略微降低。而ISO誘導(dǎo)小鼠1d即誘導(dǎo)cyclin A2、B1、CDK1mRNA表達(dá)驟升，且cyclin B1mRNA持續(xù)增高至3d達(dá)峰值，而其他所有周期因子均于7d時(shí)達(dá)峰值，隨后一直呈減少趨勢(shì);在21d時(shí)，cyclin B1、E1mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)。p2

15、1和p27mRNA表達(dá)量隨ISO作用時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增和遞減趨勢(shì)，p27mRNA于3d時(shí)表達(dá)最低;p21、p27mRNA均于14d達(dá)峰值，在21d時(shí)表達(dá)量雖有所降低，但仍然高于正常對(duì)照組。然而TP在減小心臟大小及改善心臟功能的同時(shí)，可顯著糾正胚胎基因β-MHC及細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclin、CDK、CKI mRNA的異常表達(dá)。
　　8.蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著ISO作用時(shí)間的延長(zhǎng)，β-MHC蛋白表達(dá)逐漸增高，于14d達(dá)峰值后表達(dá)量又減少

16、。在ISO處理3d后cyclin D1、CDK6蛋白表達(dá)達(dá)峰值，隨后一直呈減少趨勢(shì)。CDK4、P21蛋白表達(dá)量均于3d達(dá)最低值，之后又快速升高。而TP可顯著糾正上述周期因子蛋白異常表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞株H9c2和NRVM細(xì)胞肥大反應(yīng)，以及小鼠心肌肥大過(guò)程中均伴隨著細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)失衡。
　　2.雷公藤甲素能顯著抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2和NRVM肥大反應(yīng)，有效減輕異丙腎上腺素誘