細胞周期調(diào)節(jié)因子在心肌肥大中的動態(tài)變化及雷公藤甲素的影響.pdf

1、心肌肥大(cardiac hypertrophy)的一個主要特征是心肌細胞體積增大，直徑增寬，及肌節(jié)數(shù)量增多，而細胞數(shù)目保持不變。盡管早期對心功能具有一定的代償作用，但長期的心肌肥大會引起心肌耗氧量增加，導致心絞痛、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)病率和死亡率明顯增高，嚴重影響心血管疾病患者的預后，因而逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展已成為防治心血管疾病的重要舉措。
　　在哺乳動物早期胚胎中，心肌細胞分裂活躍，以適應心臟快速增長的需

2、要。但出生后不久，周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)表達量均迅速降低，而CDK抑制因子(CDK inhibitor，CDKI)則快速增加，促使心肌細胞退出細胞周期，成為一種高度分化的終末細胞。然而，大量的研究發(fā)現(xiàn)，在病理刺激下，成熟的心肌細胞能重返細胞周期，細胞周期調(diào)節(jié)因子再度激活表達，共同促進DNA和蛋白質(zhì)合成，但卻無法順利完成有絲分裂，表現(xiàn)為心肌細胞肥大。細胞周期是

3、在細胞周期正調(diào)控因子（cyclin-CDK復合物）和負調(diào)控因子(CDKI)共同調(diào)節(jié)下完成的。研究心肌肥大過程中細胞周期調(diào)節(jié)因子的動態(tài)變化，對于深入了解心肌肥大的發(fā)生發(fā)展機制，以及尋找新的防治靶點具有重要價值。
　　雷公藤甲素(triptolide，TP)來源于雷公藤屬植物，具有調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞周期調(diào)節(jié)因子表達的作用。然而，TP對心肌細胞周期調(diào)節(jié)因子的影響如何尚不明確。本課題旨在研究在心肌肥大過程中細胞周期調(diào)節(jié)因子的時相性表達變化及

4、TP對其表達的影響，探討通過調(diào)節(jié)細胞周期防治心肌肥大的可行性。
　　方法:
　　1.血管緊張素(angiotensinⅡ，AngⅡ)1.0μmol·L-1分別處理H9c2細胞5、10、30min，和1、2、3、6、12、24、48h，羅丹明標記鬼筆環(huán)肽染色并檢測細胞面積;real-time PCR法檢測細胞周期蛋白B1、D1、E1，CDK1、2、4、6，以及CDK抑制因子p21mRNA的表達變化情況。
　　2.分離培養(yǎng)

5、新生大鼠心肌細胞(neonatal rat ventricular myocytes，NRVM)，AngⅡ分別處理5、10、30min和1、2、3、6、12、24h，采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期的變化。
　　3.同上方法采用AngⅡ處理NRVM，分別加入雷公藤甲素(triptolide，TP)1.0μg·L-1孵育不同時間。鬼筆環(huán)肽染色檢測細胞面積;real-time PCR法檢測β-肌球蛋白重鏈(myosin heavy chai

6、n，MHC)mRNA和細胞周期調(diào)節(jié)因子mRNA的表達情況;Westernblot法檢測蛋白表達情況。
　　4.動物模型建立及藥物干預:健康清潔級雄性C57小鼠72只，隨機分為異丙腎上腺素組(isoprenaline，ISO)和TP治療組，各6個時相點，共12組(n=6)。ISO(10mg·kg-1，sc，bid)制備心肌肥大模型，TP（10μg·kg-1·d-1，ip，qd）分別處理0、1、3、7、14、21d。
　　5.密

7、切觀察小鼠生活狀況及死亡情況。末次給藥后，稱量體重(BW)和心重(HW)，測量小鼠脛骨長度(TL)，以HW/TL作為心臟指數(shù)。分別采用HE和Masson染色觀察心肌組織病理變化與膠原沉積情況;麥胚凝集素染色觀察計算細胞平均面積。
　　6.采用real-time PCR法檢測β-MHC及細胞周期因子cyclin A2、B1、D1、E1，CDK1、2、4、6，p21、p27mRNA的表達變化情況;Western blot法檢測β-MH

8、C、cyclinD1、CDK4、CDK6、P21蛋白表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.隨著AngⅡ刺激時間的延長，H9c2細胞面積逐漸增大;細胞周期調(diào)節(jié)因子均于刺激后出現(xiàn)短暫反應性表達增加，cyclin E1與CDK2、CDK4mRNA在5min時達到峰值，cyclin D1mRNA在10min時達到峰值，隨后一直呈減少趨勢;CDK6與cyclin B1mRNA表達出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，分別于5和30min達第一峰，隨后表達減少，于2

9、h達最低點，接著又表達增加，于12h達第二峰。p21mRNA表達量于30min達峰值，隨后逐步減少，3h時表達最低，之后又緩慢增加。
　　2.與H9c2細胞相比，隨著刺激時間的延長，NRVM細胞肥大反應更為明顯，6h后細胞面積增加呈加速趨勢。與對照組相比，經(jīng)TP處理后，細胞面積升高趨勢明顯減弱。流式細胞術(shù)檢測細胞周期結(jié)果顯示，在AngⅡ刺激下，NRVM細胞G1期細胞數(shù)減少，S+G2期的細胞數(shù)明顯增加。
　　3.AngⅡ處理5

10、min時，NRVM細胞β-MHC、cyclin A1、p21、p27mRNA出現(xiàn)反應性小幅度表達增加;p21mRNA于30min達極大值。β-MHC mRNA于刺激6h表達最低，隨后其表達量隨刺激時間增加而驟升，于48h達最大值，這與細胞面積肥大結(jié)果相一致。此外，CDK1、2、4、6、cyclin B1、D1、p21mRNA均于2h表達最低，cyclin A1和p27mRNA表達量在1h時達最低位，cyclin E1mRNA于3h時表達

11、最低;之后隨著刺激時間的延長，細胞周期因子表達均出現(xiàn)回升，cyclin A1mRNA于3h表達達峰值;然而在AngⅡ刺激24～48h，僅CDK1、p21、p27mRNA表達升高較顯著(P＜0.01)，其它的周期正調(diào)控因子雖有緩慢增加，但均維持在較低水平;而TP在減小細胞面積的同時能夠糾正細胞周期因子mRNA的異常表達。
　　4.蛋白檢測結(jié)果顯示，隨著AngⅡ處理時間增加，β-MHC、CDK4、CDK6蛋白表達逐漸減少;而P21于刺

12、激30min短暫升高后又迅速降低，CDK4、P21均于2h達最低值，CDK6與β-MHC均于30min達最低位，而后隨刺激時間的增加而遞增;在AngⅡ刺激12～24h，所以蛋白表達均達到最大值。在細胞肥大過程中，就細胞周期因子在mRNA和蛋白水平上表達變化而言，AngⅡ?qū)Φ鞍妆磉_的影響較mRNA更明顯;而TP可明顯糾正上述細胞周期因子蛋白表達異常。
　　5.ISO處理組小鼠皮毛暗淡無光澤，呼吸急促，活動較少，反應遲鈍，隨著ISO作

13、用時間增加，上述反應越明顯;與模型組相比，TP組小鼠活動與進食情況明顯改善。
　　6.ISO處理3d后，小鼠HW/TL比值開始顯著升高，細胞面積增大，并隨著時間的延長而持續(xù)增加，同時出現(xiàn)心肌纖維斷裂、炎細胞浸潤和膠原沉積。TP能明顯降低心臟指數(shù)，改善心肌組織損傷，減輕纖維化。
　　7.在ISO誘導小鼠心肌肥大過程中，β-MHC、cyclin D1、E1、CDK2、4、6mRNA表達逐漸減少，其中β-MHC、cyclin D1

14、、CDK6mRNA于1d時達最低值，cyclin E1、CDK2、4mRNA于3d時達谷值，隨后表達量均又逐漸升高;β-MHC mRNA于14d達峰值后表達略微降低。而ISO誘導小鼠1d即誘導cyclin A2、B1、CDK1mRNA表達驟升，且cyclin B1mRNA持續(xù)增高至3d達峰值，而其他所有周期因子均于7d時達峰值，隨后一直呈減少趨勢;在21d時，cyclin B1、E1mRNA表達較正常對照組顯著降低(P＜0.01)。p2

15、1和p27mRNA表達量隨ISO作用時間延長呈遞增和遞減趨勢，p27mRNA于3d時表達最低;p21、p27mRNA均于14d達峰值，在21d時表達量雖有所降低，但仍然高于正常對照組。然而TP在減小心臟大小及改善心臟功能的同時，可顯著糾正胚胎基因β-MHC及細胞周期調(diào)控因子cyclin、CDK、CKI mRNA的異常表達。
　　8.蛋白檢測結(jié)果顯示，隨著ISO作用時間的延長，β-MHC蛋白表達逐漸增高，于14d達峰值后表達量又減少

16、。在ISO處理3d后cyclin D1、CDK6蛋白表達達峰值，隨后一直呈減少趨勢。CDK4、P21蛋白表達量均于3d達最低值，之后又快速升高。而TP可顯著糾正上述周期因子蛋白異常表達。
　　結(jié)論:
　　1.體外培養(yǎng)心肌細胞株H9c2和NRVM細胞肥大反應，以及小鼠心肌肥大過程中均伴隨著細胞周期調(diào)節(jié)因子的表達失衡。
　　2.雷公藤甲素能顯著抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞H9c2和NRVM肥大反應，有效減輕異丙腎上腺素誘