急性應激對小鼠行為學改變和血清CREB表達的影響.pdf

1、急性應激障礙(acute stress disorder，ASD)是指機體在經歷應激后數分鐘到數小時開始出現的一過性精神障礙，表現為分離、回避、再體驗與高喚醒三個特征性癥狀群，2-3天最明顯，一般持續(xù)3天到一周，影響機體正常工作和生活。機體在急性應激期表現為中樞神經系統(tǒng)的完整性不變，但神經遞質和神經內分泌系統(tǒng)功能發(fā)生改變，此時與應激相關的中樞組織如海馬、杏仁核、下丘腦和前腦皮層等，發(fā)生功能甚至結構上的變化，從而導致一系列行為改變。轉錄因

2、子cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是中樞神經系統(tǒng)內一種與刺激相關的重要核蛋白，應激后CREB自身磷酸化成為P-CREB，處于活化狀態(tài)，進一步發(fā)揮保護神經元、修復和促進神經元再生的功能。CREB在中樞與應激的關系已受到密切關注且研究較為成熟，但目前關于外周組織CREB表達與應激的關系尚不清楚，應激后外周血液中CREB表達量如何變化，CREB與P-CREB表達是

3、否存在與中樞一致的改變，血液中CREB含量變化與應激后行為變化是否存在相關性等都是需要探討的問題。本研究以不可逃避足底電擊方式建立急性應激小鼠模型，以礦場實驗、高架十字迷宮實驗評價小鼠應激后的焦慮及探索行為，以Morris水迷宮實驗評價小鼠學習記憶功能，檢測CREB在血清和海馬中不同時間的變化特點，探討行為變化與CREB表達的相關性。
　　目的:
　　(1)分析急性應激后小鼠的行為改變特點;
　　(2)尋找應激后小鼠血

4、清中CORT、CREB、P-CREB表達以及海馬CREB、P-CREB表達隨時間變化的規(guī)律;
　　(3)探討急性應激后CREB、P-CREB在血清中的表達與行為學變化的相關性。
　　方法:
　　(1)研究對象及分組方法
　　以C57小鼠為實驗研究對象，采用組間隨機對照設計方法，將行為學實驗評分相近的108只小鼠隨機分為應激組和對照組，每組54只;再將每組按電擊后0h、6h、12h、24h、26h、48h、72h、

5、7d和21d九個時相點隨機分成九小組，按小組順序先后被放入電擊箱，應激組小鼠接受足底電擊，對照組只進入電擊箱，但不接受任何處理。行為學實驗分為曠場實驗、高架十字迷宮實驗和水迷宮實驗(電擊后26h)，按時間順序在每個時相點從兩組各取相應的6只小鼠進行行為學評價程序;行為學測試結束后，立即取靜脈血檢測血清CREB、P-CREB、CORT濃度，取血后斷頭取腦分離出海馬組織，檢測齒狀回中CREB、P-CREB表達。
　　(2)建模方式及行

6、為學評價方法
　　急性應激采用不可避免足底電擊方式，將小鼠置于長×寬×高(18cm×13cm×22cm)的電擊箱中，給予10次足底電擊（電流1.5mA，持續(xù)6s，間隔時間15s）。
　　記錄曠場實驗中，10min內小鼠中央區(qū)域活動路程、中央區(qū)域活動時間、站立次數，用以評價小鼠自發(fā)行為、焦慮和探索行為;記錄高架十字迷宮實驗中，5min內小鼠進入開臂的次數(OE)、待在閉臂的時間(CT)，用以評價小鼠焦慮及探索行為;記錄小鼠Mo

7、rris水迷宮實驗中，前四天的逃避潛伏期以評價小鼠的空間學習能力，第五天穿越平臺次數及目標象限游程比例以評價小鼠空間記憶能力。
　　(3)血清和海馬組織CORT、CREB及P-CREB表達的檢測方法
　　分別在每組行為測試完成后立即取血，離心取血清，采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測CORT、CREB、P-CREB含量;取血后立即斷頭取海馬組織，采用免疫組織化學(IHC)方法檢測小鼠海馬齒狀回CREB和P-CREB表達。<

8、br>　　(4)統(tǒng)計學方法
　　用SPSS18.0軟件包對實驗數據進行統(tǒng)計學處理，采用非配對t檢驗進行電擊組和對照組的比較，兩組不同時間各指標間總體比較采用單因素方差分析，水迷宮定位航行訓練中兩組逃避潛伏期采用重復測量方差分析，各觀察指標間相關性采用pearson相關分析;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　(1)體重變化
　　電擊前兩組小鼠體重間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;對照組小鼠體重在

9、12h開始增長，48h及之后的體重與電擊前比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);應激組小鼠體重在電擊后72h開始增長，7d及以后的體重與電擊前比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　(2)電擊箱內情況
　　應激組和對照組小鼠比較，電擊箱內跳躍次數、僵直時間和不動時間在每個時間點差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;兩組小鼠各指標在不同時間點間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(3)行為學變化
　　與

10、對照組比較，急性應激組小鼠的站立次數在6h、12h、72h顯著減少(P＜0.05)，中央區(qū)域活動路程在電擊后0h、6h、12h、72h顯著減少(P＜0.05)，中央區(qū)域活動時間在電擊后6h、12h、24h、72h、7d、21d顯著降低（P＜0.05），進入開臂次數在6h、12h、72h顯著減少(P＜0.05)，閉臂停留時間在6h、12h、48h、72h、7d顯著增加(P＜0.05)。
　　兩組小鼠逃避潛伏期都隨時間降低，應激組第3

11、天與第1天差異顯著(P＜0.01)，第4天與第1、2、3天差異顯著(P＜0.01);對照組第2、3、4天與第1天差異顯著（P＜0.05）;與對照組比較，急性應激組小鼠在第1、2天逃避潛伏期顯著延長(P＜0.01)，第4天逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.05)，第5天穿越平臺次數顯著增多(P＜0.01)，但兩組小鼠在目標象限的游程比例無顯著性差異(P=0.114)。
　　(4)血清CORT，CREB及P-CREB含量
　　與對照組

12、比較，急性應激組小鼠血清CORT濃度在0h、6h、12h、48h、72h顯著升高(P＜0.01)，血清CREB濃度在0h、6h、12h(P＜0.01)和72h(P＜0.05)顯著降低，血清P-CREB濃度在電擊后0h、6h(P＜0.01)和72h(P＜0.05)顯著升高，電擊后24h、21d降低但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　(5)海馬CREB，P-CREB表達
　　應激組小鼠海馬齒狀回CREB的表達在電擊后0h、

13、6h顯著少于電擊后12h、24h（P＜0.01）;與對照組比較，急性應激組CREB陽性細胞數在電擊后0h、6h、7d和21d顯著減少(P＜0.05)。
　　應激組小鼠海馬齒狀回P-CREB的表達在電擊后0h、6h、12h、48h、72h顯著強于電擊后24h、7d、21d(P＜0.05)，電擊后24h明顯強于電擊后7d、21d(P＜0.05);與對照組比較，急性應激組齒狀回P-CREB的表達在電擊后0h、6h、72h顯著增強(P＜0

14、.05)，電擊后7d、21d顯著減弱(P＜0.05)。
　　水迷宮實驗后，急性應激組小鼠齒狀回CREB表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，P-CREB表達較對照組顯著增加（P＜0.05）。
　　(6)CREB，CORT，P-CREB與行為學指標間的相關性
　　應激組和對照組小鼠曠場中站立次數、中央區(qū)域活動路程、中央區(qū)域活動時間均呈顯著正相關(P＜0.05)，且應激組OE與CT呈顯著負相關(P＜0.01);應激組各曠場指標

15、與OE均呈顯著正相關(P＜0.01)，站立次數、中央區(qū)域活動時間與CT呈顯著負相關(P＜0.01)，對照組中央區(qū)域活動路程與OE呈顯著正相關(P＜0.05)。
　　應激后小鼠血清CREB與P-CREB、CORT呈顯著負相關（P＜0.01），P-CREB與CORT呈顯著正相關（P＜0.01），血清CREB濃度與曠場各指標、OE均呈顯著正相關（P＜0.05），血清P-CREB濃度與中央區(qū)域活動路程、OE呈顯著負相關(P＜0.05)，對

16、照組各指標間相關性均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結論:
　　(1)急性應激可導致小鼠自發(fā)活動及探索樣行為減少、焦慮恐懼增加，但探索行為恢復較快，焦慮行為恢復緩慢。
　　(2)急性應激對小鼠行為改變的影響在應激后12h內明顯，24h基本恢復，但應激后48h和72h小鼠行為再次出現顯著改變，該時間段可能處于應激后高喚醒敏感時期。
　　(3)急性應激后小鼠學習能力逐漸增強，在應激后期表現明顯，且急性應激可促進小

17、鼠記憶功能增強及對空間定位的準確性。
　　(4)急性應激后小鼠血清中存在CREB、P-CREB的表達，在應激后早期血清濃度變化最明顯，且血清改變與海馬CREB表達存在一定平行關系;急性應激可降低血清及海馬CREB表達但可以增強P-CREB表達。
　　(5)急性應激后小鼠行為改變與血清CREB、P-CREB含量存在一定相關性。
　　研究結果說明，急性應激致小鼠行為改變與CREB的表達變化具有一定時空相關性，外周血液中CR