基于核酸工具酶輔助信號(hào)放大策略的高靈敏生物傳感器構(gòu)筑研究.pdf

1、本論文基于核酸工具酶和DNAzyme輔助的信號(hào)放大策略，成功構(gòu)筑了三種新穎的、高靈敏的核酸傳感檢測(cè)平臺(tái)，分別實(shí)現(xiàn)了核酸、蛋白及生物酶的高靈敏熒光分析檢測(cè)。
　　第二章，基于外切酶Ⅲ輔助靶標(biāo)自催化循環(huán)、DNAzyme信號(hào)放大策略，構(gòu)建了一種高靈敏的熒光DNA生物傳感器。本章設(shè)計(jì)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針DNA，含有靶標(biāo)DNA的識(shí)別片段和DNAzyme序列，但DNAzyme序列被隱藏在發(fā)夾內(nèi)部而無(wú)活性。靶標(biāo)DNA存在時(shí)，會(huì)與探針DNA雜交識(shí)別，

2、誘導(dǎo)外切酶Ⅲ識(shí)別切割，釋放出靶標(biāo)DNA、二次靶標(biāo)DNA片段，繼續(xù)催化外切酶Ⅲ切割循環(huán)。同時(shí)，功能化的DNAzyme片段從探針結(jié)構(gòu)中釋放出來(lái)，在金屬離子作用下切割熒光底物，產(chǎn)生熒光響應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的高靈敏分析。此傳感器針對(duì)靶標(biāo)DNA的檢測(cè)下限可達(dá)20fM。
　　第三章，基于催化發(fā)夾狀DNA組裝編程的Mg2+-DNAzyme擴(kuò)增策略，構(gòu)建了一種針對(duì)蛋白質(zhì)和核酸高靈敏熒光檢測(cè)的新方法。針對(duì)蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)，進(jìn)一步結(jié)

3、合終端保護(hù)策略，以親和素作為分析物，與生物素標(biāo)記的單鏈DNA親和作用后，抑制外切酶Ⅰ對(duì)單鏈DNA的消解。進(jìn)一步誘導(dǎo)發(fā)夾狀DNA的催化組裝，產(chǎn)生具有切割活性的DNAzyme結(jié)構(gòu)，Mg2+作用下，切割底物，產(chǎn)生熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)親和素的均相高靈敏分析檢測(cè)。針對(duì)親和素的檢測(cè)限可達(dá)2pM。這種基于催化發(fā)夾狀DNA組裝編程的Mg2+-DNAzyme雙信號(hào)放大檢測(cè)策略，也被擴(kuò)展應(yīng)用于DNA的高靈敏分析檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)0.5pM，且具有很好的選擇性。

4、r>　　第四章，基于等溫鏈置換擴(kuò)增技術(shù)，結(jié)合DNAzyme信號(hào)放大策略，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性的高靈敏分析檢測(cè)。設(shè)計(jì)發(fā)夾探針DNA和模板DNA，探針DNA上含有甲基化轉(zhuǎn)移酶的識(shí)別位點(diǎn)。DNA甲基化后，可阻止限制性?xún)?nèi)切酶切割發(fā)夾DNA，在聚合酶和切刻內(nèi)切酶的輔助下，聚合產(chǎn)生大量DNA片段。在模板DNA作用下，進(jìn)一步通過(guò)鏈置換雜交反應(yīng)擴(kuò)增出大量具有切割酶活性的DNAzyme片段，實(shí)現(xiàn)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的高靈敏熒光分析檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)