基于滾環(huán)擴(kuò)增和核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)放大的高靈敏熒光生物傳感器研究.pdf

1、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)作為一種等溫放大過程，有著極強(qiáng)的核酸擴(kuò)增能力，不僅可直接對特定的DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，還能將靶核酸的信號(hào)進(jìn)行放大，得到一條由環(huán)形DNA模板互補(bǔ)序列串聯(lián)組成的長單鏈DNA。通過設(shè)計(jì)環(huán)形DNA模板的序列，可賦予RCA產(chǎn)物藥物負(fù)載、靶標(biāo)識(shí)別、熒光成像等功能。核酸外切酶Ⅲ因其高效的催化水解能力以及對3'端平齊或凹陷的雙鏈DNA特異的識(shí)別能力被廣泛應(yīng)用到信號(hào)放大戰(zhàn)略中。本研究論文將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)放大技術(shù)與生物傳

2、感方法相結(jié)合，構(gòu)建了一種多重信號(hào)放大的熒光生物傳感平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)對核酸酶、micro RNA、小分子物質(zhì)和離子的檢測。
　　(1)第二章，基于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)輔助循環(huán)放大，構(gòu)建了一個(gè)穩(wěn)健的傳感平臺(tái)用于S1核酸酶的高靈敏檢測。將S1核酸酶的底物DNA鏈(sDNA)設(shè)計(jì)成引發(fā)RCA的引物DNA鏈，得到的RCA產(chǎn)物與大量TaqMan探針互補(bǔ)雜交形成TaqMan探針3'端凹陷的雙鏈結(jié)構(gòu)，在ExoⅢ的存在下，TaqM

3、an探針從3'端開始被水解，其上的熒光基團(tuán)被釋放產(chǎn)生熒光信號(hào)。與此同時(shí)，3'端凸出的RCA產(chǎn)物則免遭酶切繼續(xù)與其它TaqMan探針雜交，循環(huán)往復(fù)，產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)體系中存在S1核酸酶時(shí)，sDNA被水解成單個(gè)或小片段的脫氧核糖核苷酸，此時(shí)缺乏引物DNA鏈，致使RCA反應(yīng)和后續(xù)的ExoⅢ輔助循環(huán)放大反應(yīng)無法進(jìn)行，從而檢測不到熒光信號(hào)，且熒光強(qiáng)度隨S1核酸酶濃度的增加而降低。由于進(jìn)行了雙重信號(hào)放大，該方法展示了極其優(yōu)異的靈敏性，對S

4、1核酸酶的檢測下限達(dá)到了5.0×10-7 UμL-1。該傳感器用于實(shí)際樣品分析中也有令人滿意的結(jié)果。
　　(2)第三章，建立了一種利用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)連接兩次核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)輔助循環(huán)放大(ExoⅢ-RCA-ExoⅢ)的熒光傳感平臺(tái)用于超靈敏地檢測microRNA。設(shè)計(jì)的3'端凸出的發(fā)夾DNA集識(shí)別靶標(biāo)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)多種功能于一體，發(fā)夾DNA和目標(biāo)micro RNA互補(bǔ)雜交后形成雙鏈部分的序列將被ExoⅢ水解移除，從而釋放出可

5、繼續(xù)打開其它發(fā)夾DNA的目標(biāo)micro RNA和引發(fā)RCA反應(yīng)的引物DNA鏈。該引物鏈可與RCA中的環(huán)形DNA模板雜交并延伸得到RCA產(chǎn)物，RCA產(chǎn)物上包含成千上萬個(gè)可與TaqMan探針互補(bǔ)雜交的序列，雜交后形成TaqMan探針的3'端凹陷、RCA產(chǎn)物3'端凸出的單雙鏈串聯(lián)結(jié)構(gòu)，在ExoⅢ的存在下，TaqMan探針被水解，熒光基團(tuán)脫離淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。該方法的動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍達(dá)到七個(gè)數(shù)量級(jí)，且檢測限達(dá)到了0.32 aM。
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6、3)第四章，基于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)輔助循環(huán)的雙重放大熒光傳感平臺(tái)，利用一些物質(zhì)（ATP、鉀離子）對S1核酸酶活性的抑制作用實(shí)現(xiàn)了對ATP和K+的檢測。S1核酸酶是單鏈特異性核酸內(nèi)切酶，因體系中存在S1核酸酶，單鏈的RCA引物鏈(t-DNA)被水解成單個(gè)或小片段的核苷酸，因此無法引發(fā)RCA反應(yīng)，后續(xù)的ExoⅢ酶切反應(yīng)也無法進(jìn)行，致使熒光信號(hào)難以被檢測。當(dāng)反應(yīng)體系中存在ATP或K+時(shí)，t-DNA因S1核酸酶的水解活